液-液相分離を応用した抗体キャリアの開発及び抗体による細胞内分子制御への展開

应用液-液相分离的抗体载体的开发及其在使用抗体的细胞内分子控制中的应用

• 批准号: 22KJ1861
• 负责人: 岩田 恭宗
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1861/
• 关键词: ペプチド; 細胞内送達; タンパク質; 抗体; 液―液相分離

1．FcB(L17E)3による生体組織への抗体の導入法の検討現状では、FcB(L17E)3による抗体との液滴による抗体の細胞内送達は培養細胞への利用に限られている。膜傷害性ペプチド―抗体液滴の生体への応用可能性を検討する必要がある。そこで、まずは、FcB(L17E)3と負電荷性蛍光タンパク質である(-30)GFPを混合し、液滴を形成させ、それをマウス皮内に投与した。一部の細胞で(-30)GFPが細胞内に移行している様子を観察することができた。この結果により、FcB(L17E)3の生体への応用可能性が示唆された。今後の方針としては、担癌マウスの腫瘍への、膜傷害性ペプチド―抗体液滴による抗体送達が可能かを検討する。２．FcB(L17E)3と効果的に液滴を形成する負電荷抗体の検討FcB(L17E)3による蛍光標識抗体の液滴化と細胞内送達手法において、蛍光標識に代わる抗体の汎用的な負電荷修飾法の検討が必要である。まず、抗体結合ペプチドZ33のC末端を、Glu、PheまたはTyrで延長したペプチド数種類を作製した。このうちGluを多く含むペプチドがFcB(L17E)3と抗体存在下かつ高濃度の条件で緩衝液中に液滴を形成した。しかし、これらの溶液を培養細胞に添加できる濃度へ希釈すると、液滴はすべて崩壊した。原因として考えられるのは、負電荷がFc領域に集中していることである。そこで、ポリグルタミン酸を抗体のリジン側鎖に、架橋剤GMBSを用いて非特異的に修飾することを検討した。負電荷修飾抗体とFcB(L17E)3を緩衝液中で混合したところ、液滴形成は確認されなかった。原因として、蛍光標識抗体と異なり、液滴形成を静電相互作用のみに依存したことが考えられる。本研究の今後の方針としては、FcB(L17E)3と疎水性相互作用をするアミノ酸（PheやTyrなど）を含めたポリグルタミン酸の検討を行う。

1.使用FcB(L17E)3将抗体导入活体组织的方法的研究目前，使用带有抗体的FcB(L17E)3液滴进行抗体的细胞内递送仅限于在培养细胞中使用。有必要研究将膜损伤肽抗体液滴应用于活生物体的可能性。因此，首先将FcB(L17E)3和带负电荷的荧光蛋白(-30)GFP混合形成液滴，然后将其皮内给药于小鼠。我们能够观察到 (-30) GFP 正在迁移到某些细胞中。这一结果表明将FcB(L17E)3应用于生物体的可能性。作为未来的计划，我们将研究是否有可能使用膜毒性肽抗体液滴将抗体递送至荷瘤小鼠的肿瘤。 2.与FcB(L17E)3有效形成液滴的带负电抗体的检查在使用FcB(L17E)3的荧光标记抗体的液滴形成和细胞内递送方法中，可以替代荧光标记的通用负电荷抗体修饰方法需要予以考虑。首先，通过用 Glu、Phe 或 Tyr 延伸抗体结合肽 Z33 的 C 末端，创建了几种类型的肽。其中，含有大量Glu的肽在FcB(L17E)3和高浓度抗体存在的情况下在缓冲溶液中形成液滴。然而，当这些溶液被稀释到可以添加到培养细胞中的浓度时，所有的液滴都会塌陷。一个可能的原因是负电荷集中在Fc区。因此，我们研究了使用交联剂 GMBS 用聚谷氨酸非特异性修饰抗体的赖氨酸侧链。当带负电荷的修饰抗体和FcB(L17E)3在缓冲溶液中混合时，没有观察到液滴形成。原因可能是，与荧光标记的抗体不同，液滴的形成仅依赖于静电相互作用。本研究未来的方向是研究含有与FcB(L17E)3具有疏水相互作用的氨基酸（Phe、Tyr等）的聚谷氨酸。