３次元細胞集合体の内部における生存機能を可視化する革新的イメージング技術の創出

创建创新成像技术以可视化 3D 细胞聚集体内的生存功能

基本信息

批准号：
18J21579
负责人：
村田勇樹
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、材料学を駆使した、3次元細胞集合体内部における生存機能を可視化するイメージング技術の創出である。令和2年度は、前年度までに確立してきたモレキュラービーコン（MB）細胞内徐放システムを3次元細胞集合体へと応用し、その内部における細胞死（アポトーシス）を可視化することを試みた。MBは、細胞内で様々な生物機能を制御するmRNAを検出する核酸イメージングプローブである。生体吸収性高分子であるゼラチンからなるナノ粒子にMBを内包させ、ゼラチンの分解とともにMBを細胞内で徐放する（=MB細胞内徐放）ことで、細胞内mRNAを特異的かつ長期的に検出可能である。細胞の生存機能を可視化するため、アポトーシス細胞特異的に発現するカスパーゼ-3のmRNAに対するMBを用い、これを内包するゼラチンナノ粒子を作製した。このナノ粒子を2次元培養においてマウス間葉系幹細胞に取り込ませ、細胞をMBにより標識した。続いて、MB標識細胞から3次元細胞凝集体を形成させることにより、その内部まで均一に標識された細胞凝集体を構築することが可能となった。この細胞凝集体に対して、分子サイズの異なる2種類の薬剤によってアポトーシスを誘導した。比較的大きな分子サイズをもつ抗Fas抗体（Fas Ab）は、凝集体表面に多く分布していた一方で、低分子薬剤であるカンプトテシンは凝集体内部まで浸透することができる。その結果、Fas Abによるアポトーシス誘導では、凝集体表面の細胞においてMBの蛍光強度が増加し、Fas Abの分布とよい相関を示した。これに対して、カンプトテシンによるアポトーシス誘導では、凝集体表面だけでなく、凝集体内部の細胞からも強い蛍光が検出された。このように、MB標識細胞から3次元細胞集合体を構築し、その内部における生存機能（アポトーシス細胞の空間的分布）を可視化する技術を開発することができた。

这项研究的目的是创建一种成像技术，利用材料科学来可视化三维细胞聚集体内的生存功能。 2020年，我们将前一年建立的分子信标（MB）细胞内缓释系统应用到三维细胞聚集体上，并尝试将聚集体内的细胞死亡（凋亡）可视化。 MB 是一种核酸成像探针，可检测控制细胞内各种生物功能的 mRNA。通过将MB封装在由明胶（一种生物可吸收聚合物）制成的纳米颗粒中，并在明胶分解时以持续的方式在细胞中释放MB（=MB细胞内持续释放），可以特异性地释放细胞内mRNA并且可以在很长一段时间内检测到。。为了可视化细胞存活功能，制备了含有 MB 的明胶纳米颗粒，用于在凋亡细胞中特异性表达的 caspase-3 mRNA。这些纳米颗粒被纳入二维培养的小鼠间充质干细胞中，并用 MB 标记细胞。接下来，通过由MB标记的细胞形成三维细胞聚集体，可以构建整体上均匀标记的细胞聚集体。使用两种不同分子大小的药物在这些细胞聚集体中诱导细胞凋亡。抗Fas抗体(Fas Ab)的分子尺寸较大，主要分布在聚集体的表面，而喜树碱是一种低分子量药物，可以渗透到聚集体的内部。结果，在Fas Ab诱导细胞凋亡后，聚集体表面细胞中MB的荧光强度增加，与Fas Ab的分布具有良好的相关性。相反，当喜树碱诱导细胞凋亡时，不仅在聚集体表面而且在聚集体内部的细胞中都检测到强荧光。通过这种方式，我们能够用 MB 标记的细胞构建三维细胞聚集体，并开发一种技术来可视化聚集体内部的生存函数（凋亡细胞的空间分布）。