Proteomic analysis of cancer biology for EMT in 3D cell culture system

3D 细胞培养系统中 EMT 癌症生物学的蛋白质组学分析

基本信息

批准号：
18F18414
负责人：
梁明秀
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-10-12 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18F18414/
关键词：
proteome mass spectrometry BONCAT secretome EMT 3D-culture TGF-b

项目摘要

本研究ではAHA標識新規合成タンパク質を簡便かつ網羅的に解析できる技術を開発し、3D培養肺癌細胞でTGFβ誘導性EMTに関連して発現変動するタンパク質を探索し、微小環境下でのEMT誘導メカニズムの解明を目指している。そのために、今年度は以下の研究を実施した。1.これまで開発したBONCAT/in-stage tip及びBONCAT/click-beads法の問題点であった、AHA標識ペプチドの濃縮効率を改善する目的で、AHAを捕捉するための新たな化合物を合成した。新規化合物を用いることで、以前の方法よりも非特異的結合ペプチド量が大幅に減少し、AHA標識ペプチドの濃縮効率が改善した。その結果、AHA修飾ペプチドの同定数が増え、少量の試料からAHA標識新規合成タンパク質を網羅的に解析することが可能となった。また本研究において開発したAHA修飾ペプチドを濃縮するための化合物について、企業と共同で特許を出願した。さらに、これらの結果をまとめて国際学術誌に論文を投稿する準備を進めている。2. 2Dと3D培養肺癌細胞をTGFβにて刺激した場合の細胞内プロテオームとリン酸化プロテオームを解析し、2倍以上発現変動(p<0.05)するタンパク質を抽出した。その結果に基づき、パスウェイ解析ソフトウェアIPAを用いて、関連する上流因子や下流の生化学的機能を予測した。上流因子については、TGFβを含めて大きな違いは検出されなかったが、下流の生化学的機能については、細胞の運動性の高まりや細胞死が抑制され生存力が向上する傾向などが、2Dよりも3D培養細胞において確認された。今後は、これまでの結果の検証を行うと共に、TGFβ刺激後の新規合成プロテオーム解析などを行い、統合的な解析を実施する予定である。

在这项研究中，我们开发了一项技术，可以轻松，全面地分析新的AHA标记的合成蛋白，并且我们正在寻找与TGFβ诱导的EMT相关的3D培养的肺癌细胞中表达的蛋白质，并旨在阐明微观环境中EMT诱导的机制。为此，我们在今年进行了以下研究：1。合成了一种新化合物，以捕获AHA，目的是提高AHA标记的肽的浓度效率，这是Boncat/stage Intage Tip和Boncat/clockat/clock-Beads方法的问题。与以前的方法相比，使用新颖的化合物显着降低了非特异性结合肽的量，从而提高了AHA标记的肽的富集效率。结果，AHA修饰的肽的数量增加了，从而可以全面分析来自少量样品的新型AHA标记的合成蛋白。此外，我们还与一家公司合作提交了专利申请，以丰富本研究中开发的AHA修饰肽的化合物。此外，我们正在准备收集这些结果，并向国际学术期刊提交论文。 2。当用TGFβ刺激2D和3D培养的肺癌细胞时，细胞内蛋白质组织和磷酸蛋白质组进行分析，并提取表达变化2倍（P <0.05）的蛋白质。根据结果，途径分析软件IPA用于预测相关的上游因素和下游生化功能。对于包括TGFβ在内的上游因素，未检测到显着差异，但是对于下游的生化功能，与2D相比，3D培养细胞的细胞运动性和抑制细胞死亡的抑制和提高的生存能力的趋势比2D的趋势提高。将来，我们计划到目前为止验证结果，并在TGFβ刺激后对新型合成蛋白质组进行分析，并进行综合分析。