Proteomic analysis of cancer biology for EMT in 3D cell culture system

3D 细胞培养系统中 EMT 癌症生物学的蛋白质组学分析

基本信息

批准号：
18F18414
负责人：
梁明秀
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-10-12 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18F18414/
关键词：
proteome mass spectrometry BONCAT secretome EMT 3D-culture TGF-b

项目摘要

本研究ではAHA標識新規合成タンパク質を簡便かつ網羅的に解析できる技術を開発し、3D培養肺癌細胞でTGFβ誘導性EMTに関連して発現変動するタンパク質を探索し、微小環境下でのEMT誘導メカニズムの解明を目指している。そのために、今年度は以下の研究を実施した。1.これまで開発したBONCAT/in-stage tip及びBONCAT/click-beads法の問題点であった、AHA標識ペプチドの濃縮効率を改善する目的で、AHAを捕捉するための新たな化合物を合成した。新規化合物を用いることで、以前の方法よりも非特異的結合ペプチド量が大幅に減少し、AHA標識ペプチドの濃縮効率が改善した。その結果、AHA修飾ペプチドの同定数が増え、少量の試料からAHA標識新規合成タンパク質を網羅的に解析することが可能となった。また本研究において開発したAHA修飾ペプチドを濃縮するための化合物について、企業と共同で特許を出願した。さらに、これらの結果をまとめて国際学術誌に論文を投稿する準備を進めている。2. 2Dと3D培養肺癌細胞をTGFβにて刺激した場合の細胞内プロテオームとリン酸化プロテオームを解析し、2倍以上発現変動(p<0.05)するタンパク質を抽出した。その結果に基づき、パスウェイ解析ソフトウェアIPAを用いて、関連する上流因子や下流の生化学的機能を予測した。上流因子については、TGFβを含めて大きな違いは検出されなかったが、下流の生化学的機能については、細胞の運動性の高まりや細胞死が抑制され生存力が向上する傾向などが、2Dよりも3D培養細胞において確認された。今後は、これまでの結果の検証を行うと共に、TGFβ刺激後の新規合成プロテオーム解析などを行い、統合的な解析を実施する予定である。

在本研究中，我们开发了一种可以轻松、全面地分析 AHA 标记的新合成蛋白质的技术，寻找与 3D 培养肺癌细胞中 TGFβ 诱导的 EMT 相关的表达变化的蛋白质，并研究了在 3D 培养的肺癌细胞中 EMT 诱导的机制。我们的目标是阐明这一点。为此，我们今年开展了以下研究。 1. 合成了一种用于捕获 AHA 的新化合物，旨在提高 AHA 标记肽的浓缩效率，这是迄今为止开发的 BONCAT/In-stage Tip 和 BONCAT/click-beads 方法的问题。与之前的方法相比，使用新化合物，非特异性结合肽的量显着减少，并且 AHA 标记肽的富集效率得到提高。结果，鉴定出的 AHA 修饰肽的数量增加，使得从少量样品中全面分析 AHA 标记的新合成蛋白质成为可能。此外，我们还与一家公司联合提交了本研究中开发的一种用于浓缩 AHA 修饰肽的化合物的专利申请。此外，我们正在整理这些结果并准备向国际学术期刊提交论文。 2.我们分析了2D和3D培养的肺癌细胞用TGFβ刺激时的细胞内蛋白质组和磷酸化蛋白质组，并提取了表达变化超过2倍的蛋白质（p<0.05）。根据结果，我们利用通路分析软件IPA预测相关上游因子和下游生化功能。包括 TGFβ 在内的上游因子没有检测到重大差异，但在下游生化功能方面，与 2D 培养细胞相比，细胞运动有增加、细胞死亡抑制和活力提高的趋势。未来，除了验证迄今为止获得的结果外，我们还计划通过分析TGFβ刺激后新合成的蛋白质组来进行综合分析。