ＤＮＡポリメラーゼηとＲＡＤ１８が関与する新たなチェックポイント機構の解析

涉及 DNA 聚合酶 η 和 RAD18 的新检查点机制分析

基本信息

批准号：
16J40244
负责人：
松尾(楠本) 理加
金额：
$ 2.08万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16J40244/
关键词：
Rad18 Polη DNA損傷トレランス DNAポリメラーゼ DNAポリメラーゼ・イータ RAD18 UV

项目摘要

DNA polymerase η (Polη)は損傷を鋳型にDNA合成を行うことができる損傷乗り越え型のDNAポリメラーゼである。Rad18は複製因子PCNAをユビキチン(Ub)化し、Polηはこの活性を促進する。また、Rad18はPolηとの直接結合や、複製因子PCNAのUb化によりPolηを損傷部位へリクルートする。我々はPolηのN末端がRad18のC末端と結合することを見出している。組換えタンパク質を用いた免疫沈降法により、Rad18との結合はPolηのN末端の方が全長よりも６倍程度強いことがわかった。この結果はPolηのC末端はRad18との結合を制御することを示唆している。また、PolηとRad18の結合はDNAにより阻害されることがわかった。これはPolηにおけるRad1結合部位とDNA結合部位が重複しているからであった。この結果から、Rad18がPolηをDNA損傷部位へリクルートするとRad18はDNAから乖離し、さらなるPCNAのUb化が起こりにくくなると考えらえる。次に、Rad18との結合に重要なPolηのアミノ酸のうち、DNAポリメラーゼ活性には影響を与えないアミノ酸KおよびLについて細胞レベルでの解析を行った。Polη欠損細胞である色素性乾皮症V群患者由来細胞にPolηのN末端、KまたはLまたはKLをAに置換したPolηのN末端を恒常的に過剰発現するベクターを導入した。これらの細胞の紫外線感受性をカフェイン存在下（チェックポイント機構が不活性化している状況）で調べたところ、KやL変異細胞は、変異がない細胞よりUV感受性が少し亢進していた。KL変異細胞はKやL変異細胞よりさらにUV感受性が亢進していた。これらの結果は、PolηのKやLがRad18との結合に重要で、このアミノ酸を介した両者の結合が紫外線応答に重要であることを示唆している。

DNA聚合酶η（Polη）是一种克服损伤的DNA聚合酶，可以使用损伤作为模板合成DNA。 Rad18 泛素化 (Ub) 复制因子 PCNA，而 Polη 则促进这种活性。此外，Rad18 通过直接结合 Polη 或将复制因子 PCNA 转换为 Ub，将 Polη 招募到受损位点。我们发现 Polη 的 N 端与 Rad18 的 C 端结合。使用重组蛋白的免疫沉淀显示，Polη 的 N 末端与 Rad18 的结合强度比整个长度的结合强度大约高 6 倍。该结果表明 Polη 的 C 末端控制与 Rad18 的结合。此外，发现 Polη 和 Rad18 之间的结合受到 DNA 的抑制。这是因为 Polη 中的 Rad1 结合位点和 DNA 结合位点重叠。这一结果表明，当Rad18将Polη招募到DNA损伤位点时，Rad18从DNA解离，使得PCNA的进一步Ub转化难以发生。接下来，在细胞水平上分析了对与Rad18结合重要的Polη氨基酸中、不影响DNA聚合酶活性的氨基酸K和L。将组成性过表达 Polη N 末端或将 K、L 或 KL 替换为 A 的 Polη N 末端的载体导入源自着色性干皮病 V 组患者的细胞，这些患者是 Polη 缺陷的细胞。当在咖啡因存在的情况下（检查点机制失活的情况）检查这些细胞的紫外线敏感性时，K 和 L 突变细胞比没有突变的细胞对紫外线稍微更敏感。 KL突变细胞比K和L突变细胞具有更强的紫外线敏感性。这些结果表明 Polη 的 K 和 L 对于与 Rad18 的结合很重要，并且两者之间通过该氨基酸的结合对于 UV 响应很重要。