FIB-SEMを用いた受精卵内における精子ミトコンドリア排除機構の形態学的解明

使用 FIB-SEM 形态学阐明受精卵中精子线粒体消除机制

基本信息

批准号：
18K14704
负责人：
尾上健太
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-01 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K14704/
关键词：
電子顕微鏡ミトコンドリア CLEM FIB-SEM オートファジー

项目摘要

ミトコンドリアは母系遺伝することが知られているが、哺乳動物において精子ミトコンドリアが積極的な排除を受けるのか否かという議論が現在も続いている。受精卵内に侵入した精子由来ミトコンドリアがどのように消失するのかを超微形態学的側面から明らかにするのを目的とし、卵細胞の“光‐電子相関顕微鏡（CLEM）法”とFIB-SEMトモグラフィー法の条件検討とともに、オートファゴソーム膜の標識法の検討を行った。卵巣より回収した未受精卵を実体顕微鏡下で１個ずつ区別し、アガロースゲルに包埋後、個別に電子顕微鏡用試料作成を行った。直径100μm以上の卵細胞をFIB-SEM観察を行うため約20μm厚の切片を作成した。ダイヤモンドナイフを加温し、切片が刃を滑りやすくする処理を施すことで、比較的滑らかな表面の切片を連続して得ることができた。得られた切片をFIB-SEMを用いて連続切削像を取得した。より簡便に試料作成する条件、FIB-SEM観察により最適な切片の厚さをさらに検討したい。オートファジーの過程を電子顕微鏡下で可視化するために、オートファゴソーム形成因子であるLC3にAPEXをタグ付けした発現ベクターを構築し、培養細胞へ過剰発現させた。APEXとDABの反応産物が隔離膜様の構造付近に観察されたものの、膜上から細胞質へ拡散しており期待したほどの標識が得られなかった。隔離膜上に局在する他のオートファジー形成因子のAPEXタグタンパク質を構築・発現し、オートファジーの標識に有効な因子を検討したい。

尽管已知线粒体是母系遗传的，但关于精子线粒体是否在哺乳动物中被主动消除仍存在争议。为了从超微形态学角度阐明侵入受精卵的精子来源的线粒体如何消失，我们除了检查卵细胞外，还使用了“光电子相关显微镜（CLEM）”和FIB-SEM断层扫描。为了确定方法的条件，我们还研究了自噬体膜的标记方法。从卵巢收集的未受精卵在立体显微镜下逐一鉴定，包埋在琼脂糖凝胶中，然后单独制备为电子显微镜标本。制备约20μm厚的切片，用于直径100μm以上的卵细胞的FIB-SEM观察。通过加热金刚石刀并使切片更容易在刀片上滑动，他们能够连续获得表面相对光滑的切片。使用 FIB-SEM 获得所获得切片的连续切割图像。我们希望利用 FIB-SEM 观察进一步研究更容易样品制备的条件和最佳切片厚度。为了在电子显微镜下可视化自噬过程，我们构建了一个表达载体，其中 APEX 被标记为 LC3（一种自噬体形成因子），并在培养细胞中过表达。虽然在隔离膜样结构附近观察到APEX和DAB的反应产物，但它从膜扩散到细胞质中，并且没有获得预期的标记水平。我们希望构建并表达位于隔离膜上的其他自噬形成因子的 APEX 标记蛋白，并研究有效标记自噬的因子。