褐藻類の有用多糖類およびカロテノイド類代謝関連酵素の探索と機能実証

褐藻中有用多糖和类胡萝卜素代谢相关酶的搜索和功能论证

• 批准号: 19H03039
• 负责人: 井上 晶
• 金额: $ 11.23万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19H03039/
• 关键词: 褐藻類; 多糖類; カロテノイド類; タンパク質; 酵素; アルギン酸; フコイダン; カロテノイド; キサントフィル; マコンブ; ワカメ; ウロン酸; ゼアキサンチン; 多糖類分解酵素; 糖代謝; ラミナラン; β-カロテン

本研究は、褐藻の多糖類とカロテノイド類の生合成や代謝に関わる酵素のタンパク質レベルでの機能実証を目的としている。多糖類では、含有量が多く、陸上植物、紅藻、および緑藻にはみられないアルギン酸を基質とする酵素の研究に取り組んだ。カロテノイド類については、リコペンから複数の酵素の作用で主要成分のフコキサンチンが生じると推測されているが、その各段階で働く酵素について、新たに構築したバキュロウィルス発現系を用いて機能を調べた。アルギン酸は、β-D-マンヌロン酸（M）とα-L-グルロン酸（G）から構成されており、まずMが連続したポリマンヌロン酸が生じ、マンヌロン酸C5-エピメラーゼ（MC5E）の作用により、一部のMがGへとエピマー化される。この酵素はアルギン酸のM/G比およびそれらの配列の制御を担っており、人工的にアルギン酸のM/G組成を制御するテーラーメイドアルギン酸技術の構築には欠かせない。これまでにマコンブやワカメなど寒冷性の褐藻から候補遺伝子をクローニングし、昆虫細胞による分泌発現系を構築してきたが、性状を評価するために十分な酵素量を得ることが困難であった。一方、亜熱帯性褐藻のオキナワモズクから単離した3種類のMC5E候補遺伝子を用いた場合には、いずれも大量発現に成功し、高純度の酵素を得ることができた。いずれの酵素もMC5E活性をもつことを明らかにするとともに、至適条件を決定した。興味深いことに、いずれの酵素も既知のマコンブのMC5Eと比較して耐熱性に優れていることが分かった。カロテノイド類については、ゼアキサンチンの変換を担うと予測した3つの候補タンパク質について、マコンブとワカメからそれらの遺伝子をクローニングし、組換えウィルスを用いて機能を調べた。いずれの酵素もゼアキサンチンの変換活性は検出することはできなかったが、酵素の熱安定性が克服すべき課題であることが分かった。

本研究旨在从蛋白质水平论证褐藻中参与多糖和类胡萝卜素生物合成和代谢的酶的功能。关于多糖，我们对以海藻酸为底物的酶进行了研究，海藻酸富含多糖，在陆地植物、红藻或绿藻中不存在。关于类胡萝卜素，推测主要成分岩藻黄质是通过多种酶的作用由番茄红素产生的，但我们使用新构建的杆状病毒表达系统研究了在每个步骤中起作用的酶的功能。海藻酸由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)组成，首先形成具有连续M的聚甘露糖醛酸，并通过甘露糖醛酸C5-差向异构酶(MC5E)的作用，形成一些。 M差向异构化为G。该酶负责控制海藻酸的M/G比例及其排列，对于构建人为控制海藻酸的M/G组成的定制海藻酸技术至关重要。迄今为止，已经从Macomb和Wakame等冷褐藻中克隆了候选基因，并构建了使用昆虫细胞的分泌表达系统，但很难获得足够量的酶来评估其特性。另一方面，当使用从亚热带褐藻冲绳海蕴中分离出的三种MC5E候选基因时，它们都成功地大量表达，并且能够获得高纯度的酶。结果表明，两种酶均具有MC5E活性，并确定了最佳条件。有趣的是，与已知的 Macomb MC5E 相比，这两种酶都具有优异的热稳定性。关于类胡萝卜素，从 Macomb 和裙带菜海藻中克隆了三种预测负责玉米黄质转化的候选蛋白的基因，并使用重组病毒研究了它们的功能。尽管无法检测到任一酶的玉米黄质转化活性，但发现酶的热稳定性是一个需要克服的问题。

项目成果

ネバネバの主成分アルギン酸の酸化的代謝経路を発見

粘性物质主要成分海藻酸氧化代谢途径的发现

水圏生物タンパク質科学の新展開

水产生物蛋白质科学新进展

• 发表时间: 2020
• 作者: 尾島孝男;西山竜士;井上晶
• 通讯作者: 井上晶

アルギン酸分解における新しい酸化代謝機構の発見

发现海藻酸盐分解新的氧化代谢机制

• 发表时间: 2022
• 期刊: バイオサイエンスとインダストリー
• 作者: 井上晶;西山竜士
• 通讯作者: 西山竜士

温帯性褐藻由来マンヌロン酸C-5エピメラーゼの酵素性状解析

温带褐藻甘露糖醛酸 C-5 差向异构酶的酶特性

• 发表时间: 2022
• 作者: 坂上美卯;大西裕季;熊木康裕;相沢智康;尾島孝男;井上晶
• 通讯作者: 井上晶

半合成多糖セロウロン酸の海洋生分解性を初めて証明～ホタテガイから分解酵素を発見～

首次证明半合成多糖纤维醛酸的海洋生物降解性 - 扇贝降解酶的发现 -