Structural biology of Trypanosoma brucei GPI phospholipase c and the development of selective inhibitors against it

布氏锥虫 GPI 磷脂酶 c 的结构生物学及其选择性抑制剂的开发

• 批准号: 19F19382
• 负责人: 山崎 和彦
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-11-08 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19F19382/
• 关键词: 寄生原虫症; 阻害剤開発; 立体構造情報; NMR分光法; 膜タンパク質; X線結晶構造解析

サハラ以南のアフリカで猛威をふるう人畜共通の疾病であり、WHO指定の「顧みられない熱帯病」であるアフリカ睡眠病に対する有効な治療薬の開発を目的とする。寄生原虫であるTrypanosoma bruceiの致死性の酵素タンパク質glycosylphosphatidylinositol (GPI)-phospholipase C (PLC)の大量発現系の構築を行った。膜結合タンパク質であるため、高難度ではあったが、高濃度で発現したタンパク質を溶解するための界面活性剤の探索を行ない、Fos-Choline-12による可溶化条件を見出した。有機溶媒をもちいた分画およびカラムクロマトグラフィーにより、高純度のタンパク質を得ることに成功した。これを用いて、フラグメント化合物ライブラリー（分子量300以下の低分子；約1000種）のスクリーニングを行った。酵素アッセイによってGPI-PLCに対する阻害活性の評価を行い、66個の化合物を選別した。さらに、NMR分光法によって強く結合するもの10個の取得に成功した。ドッキングシミュレーションを行うことによって、これらの10化合物の結合モードについて、知見を得た。これは、今後の治療薬開発のための重要な基盤となる。当初は、複合体結晶を調製し、実験データとして結合モードを解析する予定であったが、残念ながら、現在までに良い結晶が作成できなかった。引き続き結晶化条件を探索し、浸潤法による複合体立体構造解析を進めることを考えている。同時に、シミュレーション結果に基づき、置換基の交換等で強力な阻害剤の創出が可能か検討する。

其目的是开发一种有效治疗非洲昏睡病的方法，这是一种在撒哈拉以南非洲地区猖獗的人畜共患疾病，被世界卫生组织指定为“被忽视的热带病”。我们构建了寄生原生动物布氏锥虫的致死酶蛋白糖基磷脂酰肌醇 (GPI)-磷脂酶 C (PLC) 的大规模表达系统。尽管这是一项艰巨的任务，因为它是膜结合蛋白，但我们寻找一种表面活性剂来溶解高浓度表达的蛋白，并找到了使用 Fos-Choline-12 的溶解条件。我们通过使用有机溶剂和柱色谱的分级分离成功地获得了高纯度的蛋白质。利用该方法筛选片段化合物库（分子量300以下的低分子，约1000种）。通过酶法评价其对GPI-PLC的抑制活性，筛选出66个化合物。此外，我们利用核磁共振波谱法成功获得了 10 种强结合化合物。通过进行对接模拟，我们获得了这 10 种化合物的结合模式的知识。这为未来治疗药物的开发提供了重要基础。最初的计划是制备复合晶体并分析结合模式作为实验数据，但遗憾的是迄今为止还没有制造出好的晶体。我们正在考虑继续探索结晶条件并利用渗透法对配合物的三维结构进行分析。同时，根据模拟结果，我们将研究是否可以通过交换取代基来创建强抑制剂。