新型線虫C. inopinataのRNAサイレンシング機構の理解への挑戦

了解新型线虫 C. inopinata RNA 沉默机制的挑战

基本信息

批准号：
18K19283
负责人：
塩見美喜子
金额：
$ 3.99万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-06-29 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K19283/
关键词：
C.inopinata RNAサイレンシング

项目摘要

トランスポゾンは生物進化を助長する一方、その転移活性はゲノム損傷ひいては不妊を引き起こす。よって、真核生物はArgonaute を中核因子とするRNAサイレンシング機構を駆使してトランスポゾンを抑制する。石垣島で新たに発見された線虫C. inopinataは、比較ゲノミクスからC. elegansの極近縁種であると認定されたが、両者の形態・生態・生殖様式は大きく異なり、核ゲノム中のトランスポゾンの含有量も非常に高い。このことからC. inopinata は特殊なRNAサイレンシング機構を進化上獲得したと予測される。Argonaute遺伝子を比較したところやはりRNAサイレンシング機構そのものが両線虫において大きく異なる可能性が示唆された。本研究課題では、C. inopinataのArgonauteに対するモノクローナル抗体を作製し、Argonauteに結合する小分子RNAのトランスクリプトーム解析及びArgonauteのインターラクトーム解析に挑戦することにした。5種類のArgonaute抗体作製に取り組み、2種類のArgonauteタンパク質抗体はすでに作製済みである。これら抗体を用いた生化学的解析を進めたが、免疫沈降の条件検討に時間を要しており、まだ良好な結果の取得までには至っていない。Argonauteの生体内局在解析も進めたが、結論には至っていない。さらなる条件検討が必要であるため、今後それを進める。免疫沈降の条件が決定されたあかつきにはそれぞれのArgonauteに結合する小分子RNAのトランスクリプトーム解析を行うと同時に、それら生合成に関する情報を収集する。例えばC. ElegansのpiRNAはその他の生物と色々な点において相同性が低く、C. Inopinata のpiRNAの在り方を理解することは非常に興味深い。

虽然转座子促进生物进化，但它们的转座活性会导致基因组损伤，并最终导致不育。因此，真核生物充分利用以Argonaute为核心因子的RNA沉默机制来抑制转座子。石垣岛上新发现的线虫C. inopinata，通过比较基因组学确定为线虫C. elegans的近亲，但两者的形态、生态和繁殖方式存在显着差异，且差异在核基因组的含量也很高。这表明 C. inopinata 进化出了一种特殊的 RNA 沉默机制。对 Argonaute 基因的比较表明，两种线虫的 RNA 沉默机制本身可能存在显着差异。在这个研究项目中，我们创建了一种针对 C. inopinata 的 Argonaute 的单克隆抗体，并尝试分析与 Argonaute 结合的小 RNA 的转录组和 Argonaute 的相互作用组。我们正在致力于生产五种类型的Argonaute抗体，并且已经生产出两种类型的Argonaute蛋白抗体。我们已经使用这些抗体进行了生化分析，但考虑免疫沉淀的条件需要时间，并且我们尚未获得良好的结果。我们还对Argonaute进行了体内定位分析，但没有得出结论。需要进一步考虑条件，所以我们将来会继续这样做。一旦确定了免疫沉淀的条件，我们将对与每个Argonaute结合的小RNA进行转录组分析，同时收集其生物合成的信息。例如，线虫piRNA在很多方面与其他生物体的同源性较低，了解C. Inopinata piRNA如何存在是非常有趣的。