STORM顕微鏡を用いた有毛細胞シナプスにおけるOtoferlinの構造機能解析

使用 STORM 显微镜对毛细胞突触中的 Otoferlin 进行结构和功能分析

基本信息

批准号：
19K09880
负责人：
鷹合秀輝
金额：
$ 2.75万
依托单位：
National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

内有毛細胞と蝸牛神経を繋ぐ求心性シナプス（内有毛細胞リボンシナプス）において神経伝達物質としてグルタミン酸が用いられており、この部位の障害によりオーディトリーニューロパチーが引き起こされる。本研究では電気生理学的手法であるパッチクランプ法に光学的手法である超解像イメージングとグルタミン酸イメージングを組み合わせ、OtoferlinをコードするOTOFの遺伝子変異による難聴の病態解明を目指す。以下に令和4年度の研究実績を記す。(1) グルタミン酸イメージングによる機能解析内有毛細胞リボンシナプスにおけるグルタミン酸放出を測定するための新規ツールとして蛍光グルタミン酸プローブを用いているが、内有毛細胞との結合能が高くないため、秒単位の時間分解能しか得られていない。令和2-3年度に内有毛細胞と同様のリボンシナプス構造を有する網膜双極細胞を用いてリボンシナプス用にプローブをカスタマイズし、ミリ秒単位でのグルタミン酸放出の時空間動態の解析を可能とした。令和4年度は、キンギョ網膜双極細胞軸索終末部を対象としてCtBP/Ribeye結合ペプチドによりリボンを標識した上で、蛍光カルシウム色素によるカルシウムイメージング、蛍光グルタミン酸色素によるグルタミン酸イメージングの同時記録を実現し、神経伝達の鍵となるカルシウム流入とグルタミン酸放出の時空間動態をリボンとの距離と関連付けながら解析することを可能とした。このような状況の中、野生型マウス蝸牛から単離した内有毛細胞を対象としてグルタミン酸イメージングを試みているが、満足のいく結果には至っていない。(2) 免疫染色法による構造解析令和4年度は論文投稿に向けて上記イメージング実験に注力したため、免疫染色法による構造解析を実施し得なかった。

谷氨酸用作连接内毛细胞和耳蜗神经的传入突触（内毛细胞带状突触）的神经递质，该区域的损伤会导致听神经病变。在本研究中，我们旨在通过将电生理膜片钳方法与超分辨率成像和谷氨酸成像的光学方法相结合，阐明编码Otoferlin的OTOF基因突变引起的听力损失的病理学。 2020财年的研究结果如下。 (1)利用谷氨酸成像进行功能分析荧光谷氨酸探针作为测量内毛细胞带状突触谷氨酸释放的新工具，但由于它们与内毛细胞的结合能力不高，只能获得时间分辨率。在 2020-3 财年，我们利用视网膜双极细胞定制了带状突触探针，该细胞具有与内毛细胞类似的带状突触结构，使得分析谷氨酸在毫秒内释放的时空动态成为可能。 2020年度，我们通过用CtBP/Ribeye结合肽标记丝带，以金鱼视网膜双极细胞的轴突末端为目标，实现了荧光钙染料的钙成像和荧光谷氨酸染料的谷氨酸成像的同时记录，这使得分析成为可能。钙流入和谷氨酸释放的时空动态，这是神经传递的关键，与距丝带的距离有关。在这种情况下，人们尝试对野生型小鼠耳蜗分离的内毛细胞进行谷氨酸成像，但结果并不理想。（2）使用免疫染色方法进行结构分析2020财年，我们重点关注上述成像实验以准备论文投稿，因此无法使用免疫染色方法进行结构分析。

项目成果

期刊论文数量（10）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

網膜双極細胞リボンシナプスにおけるグルタミン酸放出の可視化

视网膜双极细胞带状突触谷氨酸释放的可视化

DOI：
发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
0
作者：
大島知子;坂本寛和;並木繁行;廣瀬謙造;立花政夫;鷹合秀輝
通讯作者：
鷹合秀輝

Spatiotemporal dynamics of glutamate release from individual ribbon and non-ribbon regions in the goldfish retinal bipolar cell terminal.

金鱼视网膜双极细胞终端单个带状和非带状区域谷氨酸释放的时空动态。

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
Tomoko Oshima-Takago;Hirokazu Sakamoto;Yukihiro Nakamura;Shigeyuki Namiki;Kenzo Hirose;Masao Tachibana;Hideki Takago
通讯作者：
Hideki Takago

Unveiling glutamate release sites at the ribbon-type synapses in the goldfish retinal bipolar cell terminal

揭示金鱼视网膜双极细胞末端带状突触的谷氨酸释放位点

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
Tomoko Oshima-Takago;Hirokazu Sakamoto;Yukihiro Nakamura;Shigeyuki Namiki;Kenzo Hirose;Masao Tachibana;Hideki Takago
通讯作者：
Hideki Takago

内有毛細胞リボンシナプスにおけるBassoonとOtoferlinによるグルタミン酸放出の制御

巴松管和 Otoferlin 在内毛细胞带突触处控制谷氨酸释放