Analysis of inhibition of membrane raft formation by anesthetic compounds using artificial membrane and budding yeast

使用人工膜和芽殖酵母分析麻醉化合物对膜筏形成的抑制作用

基本信息

批准号：
19J13923
负责人：
松本惇志
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

麻酔薬の作用機構は未解明である。化合物の脂溶性が高いほど麻酔作用が強くなるMeyer-Overton相関に基づいて、細胞の主要な脂溶性画分である脂質膜を麻酔薬の標的と考える脂質説が古くから提唱されている。一方、生体膜上では、特定の脂質やタンパク質が集積したナノ～マイクロスケールの領域（膜ドメイン）多様に形成されていると考えられている。本研究では、n-アルコールが脂質に作用して膜ドメインの形成を阻害することで、動物に対する麻酔作用や微生物に対する増殖阻害作用などの様々な生物作用を引き起こすと考え、膜ドメインに対する麻酔薬の影響を解析することを試みた。本年度は、昨年度に確立した、直径10-100 μm程度の巨大脂質膜小胞（giant unilamellar vesicle: GUV）の調製システムをさらに改良し、ステージ温度を自由に管理した状態での観察を可能にした。この実験系を用いて、18:0-ホスファチジルコリン（DSPC）、18:1-ホスファチジルコリン（DOPC）、コレステロールの３成分を主成分とするGUVを調製し、脂質の割合を変えることで様々なドメイン構造が観察されることを確認した。そのうち、生体膜と類似の液体秩序相（Lo相）と液体無秩序相（Ld相）が共存する脂質組成のGUVを用いて、アルコール存在下でドメイン形成に変化が起こるかを検討した。各鎖長のアルコール（C2-C12）存在下で、GUVのドメイン形成は濃度依存的に阻害された。濃度作用曲線からドメイン形成を50%阻害する濃度を求めると、鎖長が長いほど作用が強くなるMeyer-Overton相関を示した。したがって、アルコールは脂質に直接作用して膜ドメイン形成を阻害し、タンパク質がなくてもMeyer-Overton相関が成り立つことが明らかとなった。

麻醉剂的作用机制尚不清楚。基于Meyer-Overton相关性，即化合物的脂溶性越高，其麻醉作用越强，脂质理论很早就被提出，该理论认为脂质膜是细胞的主要脂溶性部分，麻醉药的目标。另一方面，在生物膜上，人们认为形成了各种纳米到微米尺度的区域（膜域），其中积累了特定的脂质和蛋白质。在这项研究中，我们假设正酒精作用于脂质并抑制膜域的形成，从而引起各种生物学效应，例如对动物的麻醉作用和对微生物的生长抑制作用，并尝试分析其影响。今年，我们进一步改进了去年建立的直径约10-100μm的巨型单层囊泡（GUV）制备系统，并可以在自由控制载物台温度的同时对其进行观察。使用该实验系统，我们制备了主要成分为18:0-磷脂酰胆碱（DSPC）、18:1-磷脂酰胆碱（DOPC）和胆固醇的GUV，并通过改变脂质的比例创建了各种域结构，并确认观察到。。使用具有类似于生物膜的液体有序相（Lo 相）和液体无序相（Ld 相）共存的脂质成分的 GUV，我们研究了在酒精存在下是否会发生域形成的变化。在存在不同链长（C2-C12）的醇时，GUV 结构域的形成以浓度依赖性方式受到抑制。当从浓度-作用曲线确定抑制结构域形成50%的浓度时，观察到Meyer-Overton相关性，其中链长越长，效果越强。因此，研究表明，酒精直接作用于脂质并抑制膜结构域的形成，并且即使在没有蛋白质的情况下，迈耶-奥弗顿相关性也成立。