Structural and functional analysis of the active state of the prostaglandin receptor

前列腺素受体活性状态的结构和功能分析

基本信息

批准号：
19J12880
负责人：
野島慎五
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は昨年度にクライオ電子顕微鏡で撮影したEP4-miniGsβγ-Gs抗体の複合体の電子顕微鏡像を元に、単粒子解析法による構造解析を行い、分解能3.3オングストロームの３次元電子顕微鏡像を取得することに成功した。また、取得した電子顕微鏡像を元に原子座標モデルを構築することにも成功した。得られた構造からEP4は、同じPGE2受容体であるEP3と同様のPGE2の結合様式をしていたが、リガンドポケットの最奥部にEP3にはない空間がEP4に存在することが判明した。また不活性型EP4に存在する、リガンドの侵入経路と思われる溝が活性型EP4では閉じていることが確認された。さらにEP4の細胞内側での膜貫通ヘリックス6（TM6）の開き具合は、他のGPCR-Gs複合体よりも小さいという特徴があった。この特徴のため、これまで解明されたGPCR-Gs複合体の構造では存在しなかった、TM2とGsのC末端との結合が確認された。これらの構造情報を元に、EP4のリガンドポケット部分およびGタンパク質結合部分のアミノ酸残基の変異体のプラスミドを作成し、HEK細胞で発現させた。このHEK細胞を利用し、cAMP依存的なルシフェラーゼを使用したレポーターアッセイによって、各残基の変異がGsシグナルの活性に及ぼす影響を調べた。その結果、リガンドポケット部分ではEP3で活性化に重要と考えられている残基に相当する残基がEP4でも活性に関与していることが明らかになった。またGタンパク質結合部分では、PG受容体に保存されているTM2のフェニルアラニン（Phe54）がEP4によるGsの活性化に重要であることが判明した。これらの知見は活性機構に基づいたEP4作動薬の開発への応用が期待される。そして以上の結果をまとめた論文を米国科学誌『Structure』に投稿し、12月１日にオンライン上で掲載された。

本财年，我们将基于去年用冷冻电子显微镜拍摄的EP4-miniGsβγ-Gs抗体复合物的电子显微镜图像，使用单粒子分析进行结构分析，并获得具有3D分辨率的三维电子显微镜图像。 3.3埃非常成功。他们还根据获得的电子显微镜图像成功构建了原子坐标模型。获得的结构表明EP4具有与EP3相似的PGE2结合模式，EP3是相同的PGE2受体，但EP4在配体口袋的最内部具有EP3所没有的空间。还证实，在EP4的非活性形式中存在的似乎是配体进入路径的凹槽在EP4的活性形式中是封闭的。此外，EP4细胞内跨膜螺旋6（TM6）的开口小于其他GPCR-Gs复合物的开口。由于这一特征，证实了TM2与Gs C末端之间的键合，而这种键合在迄今为止阐明的GPCR-Gs复合物的结构中并不存在。基于该结构信息，我们构建了EP4配体口袋和G蛋白结合区含有氨基酸残基突变体的质粒，并在HEK细胞中表达它们。使用这些 HEK 细胞，我们通过使用 cAMP 依赖性荧光素酶的报告基因测定研究了每个残基突变对 Gs 信号活性的影响。结果表明，配体口袋中被认为对 EP3 激活很重要的相同残基也参与 EP4 活性。此外，在G蛋白结合区，PG受体中保守的TM2的苯丙氨酸（Phe54）被发现对于EP4激活Gs很重要。这些发现有望应用于基于激活机制的EP4激动剂的开发。总结上述结果的论文提交给美国科学杂志《Structure》，并于12月1日在线发表。

项目成果

期刊论文数量（1）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Cryo-EM Structure of the Prostaglandin E Receptor EP4 Coupled to G Protein.

与 G 蛋白偶联的前列腺素 E 受体 EP4 的冷冻电镜结构。

DOI：
10.1016/j.str.2020.11.007
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
5.7
作者：
Nojima S; Fujita Y; Kimura KT; Nomura N; Suno R; Morimoto K; Yamamoto M; Noda T; Iwata S; Shigematsu H; Kobayashi T.
通讯作者：
Kobayashi T.

Cryo-EM Structure of the Prostaglandin E Receptor EP4 Coupled to G Protein.

与 G 蛋白偶联的前列腺素 E 受体 EP4 的冷冻电镜结构。

DOI：
10.1016/j.str.2020.11.007
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
5.7
作者：
Nojima S; Fujita Y; Kimura KT; Nomura N; Suno R; Morimoto K; Yamamoto M; Noda T; Iwata S; Shigematsu H; Kobayashi T.
通讯作者：
Kobayashi T.