Structure-based analysis of the central itch receptors aiming at development of new medicine for chronic itch and cancer

基于结构的中枢瘙痒受体分析，旨在开发治疗慢性瘙痒和癌症的新药

基本信息

批准号：
19K07358
负责人：
井上明俊
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究はGPCRファミリーである中枢痒み受容体GRPRのX線結晶解析やクライオ電顕を用いた構造解析を行い、痒み治療薬開発に重要な情報を得ることを目的とする。また、GRPRは肺がんや大腸がんなどの様々ながんにおいて過剰発現し、がん細胞の増殖や分化に関わる発がん因子でもある。そこで、本研究では構造解析の過程で作製するGRPRの立体構造認識抗体から阻害活性を持つものをスクリーニングし、がんの抗体医薬としての有用性を検証することを目的とする。一般的にGPCRは大部分が細胞膜に埋もれているうえに、活性型と不活性型の平衡状態で存在するため構造的にゆらぎが多く、大量変現が難しい。そこで、GRPRのC末端にGFPを結合させた融合タンパク質GRPR-GFPに様々な安定化変異を導入し、HEK293細胞に発現させ、蛍光検出機を備えたHPLCを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行いGRPR-GFPの発現量と安定性をGFPのピークを指標に解析した。GRPRは発現が不安定であり野生型のGRPR-GFPではほとんど発現のピークが確認できなかったが、N末、C末の欠損や点変異の導入、細胞内第3ループへの融合タンパク質bRILの導入を組み合わせることによりGRPRの構造的な安定化と高発現化に成功した。これにより、HEK293細胞を用いた大量培養系を用いてGRPRの安定化変異体（ｂRILあり、bRILなし）のタンパク質精製を行った。現在、GRPRの安定化変異体(bRIL導入あり)はbRIL抗体との複合体を作製し、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を行っている。また、GRPRの安定化変異体(bRIL導入なし)はマウスに免疫しGRPRの機能性抗体の作製を行い、得られた抗体に関して結合能や阻害活性の評価を行っている。

本研究的目的是利用X射线晶体学和冷冻电子显微镜对GPCR家族成员中枢瘙痒受体GRPR进行结构分析，以获得止痒药物开发的重要信息。 GRPR在肺癌、结直肠癌等多种癌症中也过度表达，是参与癌细胞增殖和分化的致癌因子。因此，本研究的目的是筛选在结构分析过程中产生的识别GRPR三维结构的抗体，并验证其作为癌症抗体药物的有用性。一般来说，GPCR大多埋藏在细胞膜中，以活性和非活性形式之间的平衡状态存在，这导致许多结构波动，使得大规模突变变得困难。因此，我们在融合蛋白GRPR-GFP中引入了各种稳定突变，该融合蛋白在GRPR的C末端附着有GFP，在HEK293细胞中表达，并使用配备荧光检测器的HPLC进行凝胶过滤色谱-表达水平。以GFP峰为指标分析GFP的稳定性。 GRPR的表达不稳定，野生型GRPR-GFP几乎观察不到表达峰，通过结合导入方法，我们成功地稳定了GRPR的结构并增加了其表达。因此，使用 HEK293 细胞的大规模培养系统对 GRPR 稳定突变体（有 bRIL 和无 bRIL）进行蛋白质纯化。目前，我们正在创建稳定的 GRPR 突变体（引入 bRIL）与 bRIL 抗体的复合物，并使用冷冻电子显微镜进行单颗粒分析。此外，我们使用稳定的 GRPR 突变体（未引入 bRIL）对小鼠进行免疫，以产生功能性 GRPR 抗体，并评估所得抗体的结合能力和抑制活性。