Structure-based analysis of the central itch receptors aiming at development of new medicine for chronic itch and cancer

基于结构的中枢瘙痒受体分析，旨在开发治疗慢性瘙痒和癌症的新药

基本信息

批准号：
19K07358
负责人：
井上明俊
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究はGPCRファミリーである中枢痒み受容体GRPRのX線結晶解析やクライオ電顕を用いた構造解析を行い、痒み治療薬開発に重要な情報を得ることを目的とする。また、GRPRは肺がんや大腸がんなどの様々ながんにおいて過剰発現し、がん細胞の増殖や分化に関わる発がん因子でもある。そこで、本研究では構造解析の過程で作製するGRPRの立体構造認識抗体から阻害活性を持つものをスクリーニングし、がんの抗体医薬としての有用性を検証することを目的とする。一般的にGPCRは大部分が細胞膜に埋もれているうえに、活性型と不活性型の平衡状態で存在するため構造的にゆらぎが多く、大量変現が難しい。そこで、GRPRのC末端にGFPを結合させた融合タンパク質GRPR-GFPに様々な安定化変異を導入し、HEK293細胞に発現させ、蛍光検出機を備えたHPLCを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行いGRPR-GFPの発現量と安定性をGFPのピークを指標に解析した。GRPRは発現が不安定であり野生型のGRPR-GFPではほとんど発現のピークが確認できなかったが、N末、C末の欠損や点変異の導入、細胞内第3ループへの融合タンパク質bRILの導入を組み合わせることによりGRPRの構造的な安定化と高発現化に成功した。これにより、HEK293細胞を用いた大量培養系を用いてGRPRの安定化変異体（ｂRILあり、bRILなし）のタンパク質精製を行った。現在、GRPRの安定化変異体(bRIL導入あり)はbRIL抗体との複合体を作製し、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を行っている。また、GRPRの安定化変異体(bRIL導入なし)はマウスに免疫しGRPRの機能性抗体の作製を行い、得られた抗体に関して結合能や阻害活性の評価を行っている。

这项研究旨在通过使用GPCR家族中央瘙痒受体GRPR的冷冻电子显微镜进行X射线晶体学和结构分析来获取瘙痒治疗药物开发的重要信息。 GRPR在包括肺癌和结肠癌在内的各种癌症中也过表达，并且是癌细胞增殖和分化的一种致癌因子。因此，这项研究旨在将抑制活性摆脱结构分析过程中产生的GRPR的3D结构识别抗体，并验证癌症作为抗体药物的有用性。通常，GPCR主要埋在细胞膜中，并且在活动形式和非活动形式之间也存在平衡状态，因此存在大量的结构波动，因此很难进行大规模的变化。因此，将各种稳定突变引入融合蛋白GRPR-GFP中，该融合蛋白GRPR-GFP与GRPR的C末端绑定，并在HEK293细胞中表达，并使用配备有荧光检测器的HPLC进行凝胶过滤色谱法，以使用GRPR-GFP的表达水平和稳定性，使用GFP峰值来分析GFP峰。尽管GRPR在表达方面是不稳定的，几乎无法在野生型GRPR-GFP中确认表达峰值，但我们能够通过结合N末端和C末端缺陷，引入点突变以及将融合蛋白Bril引入第三个细胞内循环，从而成功稳定并高度表达GRPR。因此，使用HEK293细胞进行了质量培养系统，对GRPR稳定突变体的蛋白质纯化（用黑色和无毛）进行。当前，GRPR的稳定突变体（带有新的介绍）是在具有黑色抗体的复合物中产生的，并且正在使用低温电子显微镜进行单粒子分析。此外，对GRPR的稳定突变体（无饰带）对小鼠免疫以产生用于GRPR的功能抗体，并评估了所得抗体的结合能力和抑制活性。