細胞質における機能性RNA生成機構の解明とRNAベクター技術への応用

细胞质中功能性RNA产生机制的阐明及其在RNA载体技术中的应用

基本信息

批准号：
19K06501
负责人：
佐野将之
金额：
$ 2.75万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K06501/
关键词：
miRNA 細胞質RNAベクター人工miRNA RNAi microRNA RNAベクター

项目摘要

センダイウイルスはネガティブ一本鎖RNAをゲノムに持つウイルスであり、宿主の細胞質において、ウイルスゲノムの複製及びウイルスmRNAの転写を行う。我々は、センダイウイルスを骨格とした非伝播型ベクターを開発しており、このベクターから発現させたmiRNA前駆体が、機能をもつ成熟miRNA にprocessingされることを確かめている。本研究では、細胞質でのmiRNA生成機構に焦点を当てており、昨年度、miRNA前駆体のprocessingに関与する因子を調べるために、ゲノム編集によりmiRNA processing因子をノックアウトした細胞株の作製を試みた。しかし、miRNA processing因子の欠損が細胞増殖に影響を与えるためか、目的クローンを得ることが困難であった。このため、本年度はprocessing因子ノックアウト株を蛍光レポーターの発現を指標に取得できる系の構築を試みた。得られたノックアウト株については、miRNA前駆体を発現するセンダイウイルスベクターを導入し、miRNA processing効率を検証した。さらに、miRNA前駆体の構造がprocessingに影響を与えることから、前駆体に変異やバルジを挿入し、それらがmiRNA processingに与える影響を検証した。また、miRNA前駆体と結合する因子を同定する目的で、細胞質でのprocessing効率が高いmiRNA前駆体を用いたプルダウンアッセイについても検証を行った。

仙台病毒是基因组中具有负单链RNA的病毒，在宿主细胞质中进行病毒基因组的复制和病毒mRNA的转录。我们开发了一种基于仙台病毒的非传染性载体，并证实该载体表达的miRNA前体被加工成功能性成熟miRNA。本研究重点关注细胞质中的miRNA产生机制，去年，为了研究参与miRNA前体加工的因素，我们尝试创建通过基因组编辑敲除miRNA加工因子的细胞系。然而，获得目标克隆很困难，可能是因为miRNA加工因子的缺乏影响了细胞增殖。为此，今年我们尝试构建一个系统，以荧光报告基因的表达为指标，获得加工因子敲除菌株。对于所得的敲除毒株，我们引入了表达 miRNA 前体的仙台病毒载体，并验证了 miRNA 的处理效率。此外，由于 miRNA 前体的结构影响加工，我们在前体中插入突变和凸起，并检查它们对 miRNA 加工的影响。此外，为了鉴定与miRNA前体结合的因子，我们还验证了使用miRNA前体的pull-down测定，其在细胞质中具有高处理效率。