繊維芽細胞増殖因子FGF5と受容体の相互作用およびアプタマーの阻害機序の解明

阐明成纤维细胞生长因子FGF5与其受体的相互作用及适配体的抑制机制

基本信息

批准号：
20K06529
负责人：
坂本泰一
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Chiba Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では，試験管内分子進化法（SELEX法）を用いて，繊維芽細胞増殖因子FGF5に結合するアプタマーの取得にすでに成功している．このアプタマーは，FGF5に対して特異的に，そして強固に結合する（解離定数Kd = 約0.1 nM）ことが明らかとなっているが，その結合メカニズムは明らかになっていない．そこで本研究では， FGF5とアプタマーの相互作用を原子座標レベルで明らかにし，相互作用メカニズムを明らかにすることを目的としている．相互作用メカニズムを明らかにした後，論理的にアプタマーを改変することを目指している．SELEX法により得られたアプタマーを短鎖化した変異体を作成し，56残基でも結合活性を保持することを明らかにした．また，アプタマーは2つのステム・ループ構造と多岐ループを持つことを明らかにし，多岐ループが結合活性に重要であることを明らかにした．このように短鎖化することによって，立体構造の揺らぎが抑えられ，X線結晶構造解析における結晶化に有効であると考えた．そこで，アプタマーとFGF5を大量に調製して，様々な条件で結晶化を試みたが，結晶は得られなかった．次に，アプタマーをさらに短鎖化したり，DNA配列の導入したキメラ型のアプタマーの作成を試みたが，結合能が低下してしまった．再度，配列を検討し，NMRによるアプタマーの構造の確認を進めている．また， FGF5の受容体であるFGFR1cを調製した．表面プラズモン共鳴（SPR）を用いた競合実験によって，アプタマーとFGFR1cは競合的にFGF5に結合することが明らかとなっている． FGF5がFGFR1cに結合するメカニズムも明らかになっていないので，FGF5とFGFR1cの複合体の結晶化も試みている．

在本研究中，我们已经利用体外分子进化方法（SELEX方法）成功获得了与成纤维细胞生长因子FGF5结合的适配体。该适配体已被证明与 FGF5 特异性且强烈结合（解离常数 Kd = 约 0.1 nM），但结合机制尚不清楚。因此，本研究的目的是在原子坐标水平上阐明FGF5与适配体之间的相互作用，并阐明相互作用机制。弄清楚相互作用机制后，我们的目标是对适体进行逻辑修饰。我们创建了通过 SELEX 方法获得的适体的缩短版本，并表明即使有 56 个残基，它也保留了结合活性。我们还揭示了适体具有两个茎环结构和一个歧管环，并阐明歧管环对于结合活性很重要。通过以这种方式缩短链，抑制了三维结构的波动，这被认为对X射线晶体学中的结晶化有效。因此，我们制备了大量的适配体和FGF5，并尝试在各种条件下使其结晶，但没有获得晶体。接下来，我们尝试进一步缩短适体或创建引入DNA序列的嵌合适体，但结合能力下降。我们正在重新检查序列并通过 NMR 确认适体的结构。我们还制备了 FGFR1c，FGF5 的受体。使用表面等离子共振 (SPR) 的竞争实验表明，适体和 FGFR1c 竞争性结合 FGF5。由于FGF5与FGFR1c结合的机制尚不清楚，我们还尝试结晶FGF5和FGFR1c的复合物。

项目成果

期刊论文数量（23）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

線維芽細胞増殖因子FGF5に対するAptamerの開発

成纤维细胞生长因子FGF5适体的开发

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
天野亮;行方昌人;堀内正隆;笹生みなみ;柳澤拓也;田中陽一郎;ガニファロハナイスラット;山本昌邦;坂本泰一
通讯作者：
坂本泰一

NMR Analysis of Interaction between Artificial Peptides and RNAs Derived from HIV-1 Rev and RRE RNA

人工肽与 HIV-1 Rev 和 RRE RNA 衍生的 RNA 之间相互作用的 NMR 分析

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
Taiichi Sakamoto; Takashi Nagata; Risa Koji; Tae Maeda; Yumi Takeda; Naohiro Kobayashi; Peter Guntert; Masato Katahira; Colin A. Smith; Kazuo Harada
通讯作者：
Kazuo Harada

NMR analysis for the development of artificial RNAs to control biomolecular functions

NMR 分析用于开发控制生物分子功能的人工 RNA

DOI：
发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
0
作者：
Kazuyuki Kumagai; Takuya Suzuki; Yuto Sekikawa; Keisuke Kamba; Li Wan; Kayoko Nagata; Akifumi Takaori
通讯作者：
Akifumi Takaori

mRNAの制御機構の解明と治療薬・ワクチンへの活用

阐明mRNA的控制机制及其在治疗药物和疫苗中的应用