In situエピジェネティクス：分化・発生のH3K27me3機能解析の新戦略

原位表观遗传学：分析分化和发育过程中 H3K27me3 功能的新策略

基本信息

批准号：
20K06449
负责人：
新井大祐
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Juntendo University (2022)Waseda University (2020-2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K06449/
关键词：
エピジェネティクスエピゲノム編集ヒストン修飾細胞分化

项目摘要

ヒストンH3の27番目のリジンのトリメチル化(H3K27me3)によるエピジェネティック制御は分化・発生に伴う遺伝子の使い分けの基盤として重要視されているが、従来の研究ではゲノム上の特定の領域のH3K27me3(in situ H3K27me3)が対応する遺伝子の制御に本当に関与しているのか、重要なのはH3K27me3ではなくPRC2の非触媒性機能ではないか、という問題が放置されていた。本研究では「ゲノム上の特定の領域のH3K27me3の機能解析（in situエピジェネティクス）」の手法を確立し、細胞分化に伴うNodal遺伝子のH3K27me3による制御機構の解明を目指している。H3K27me3とPRC2自身のどちらが機能に必要なのかを調べるために、H3K27me3の機能とPRC2の非触媒性の機能を独立にON・OFF可能なES細胞（PRC2スイッチES細胞）の作出を進めている。PRC2は触媒サブユニットとしてEZH2とEZH1のどちらか一つを含む。当初計画では内在性のEZH2をAID法により分解除去する予定だったが、最近、分解効果と特異性の高いAID2法が発表されたため、こちらを採用することとした。OsTIR（F74G）の発現カセットと酵素活性を持たないEZH2変異体のTet-ON発現カセットをROSA26領域にノックイン導入したES細胞株を樹立した。本研究において開発されたノックイン新手法（BiPoD法）は2領域への同時両アリルノックインが可能である。ES細胞の分化能を保つためには、細胞株樹立に要する時間は短いほど望ましい。そこでEzh1遺伝子全長の欠失とEzh2 C末端へのAIDタグの挿入を同時に行えるか、条件を検討した。

组蛋白 H3 第 27 位赖氨酸 (H3K27me3) 的三甲基化引起的表观遗传调控被认为是分化和发育过程中选择性使用基因的重要基础，但常规研究表明 H3K27me3（原位H3K27me3是否真正参与相应基因的调节，以及PRC2的非催化功能是否重要而不是H3K27me3的问题尚未得到解答。本研究旨在建立一种“H3K27me3在基因组特定区域的功能分析（原位表观遗传学）”的方法，并阐明H3K27me3在细胞分化过程中控制Nodal基因的机制。为了研究功能是否需要 H3K27me3 或 PRC2 本身，我们正在创建 ES 细胞（PRC2 转换的 ES 细胞），它可以独立打开和关闭 H3K27me3 的功能以及 PRC2 的非催化功能。 PRC2 包含 EZH2 或 EZH1 作为催化亚基。原计划是使用AID方法分解去除内源性EZH2，但最近公布了AID2方法，该方法分解效果好，特异性高，所以我们决定使用该方法。我们建立了一个 ES 细胞系，其中 OsTIR (F74G) 表达盒和不具有酶活性的 EZH2 突变体 Tet-ON 表达盒被敲入 ROSA26 区域。本研究开发的新的敲入方法（BiPoD 方法）允许将两个等位基因同时敲入两个区域。为了维持ES细胞的分化潜力，希望建立细胞系所需的时间尽可能短。因此，我们研究了可以同时删除全长 Ezh1 基因并在 Ezh2 的 C 末端插入 AID 标签的条件。