Elucidation of physiological function of free N-glycans and application of the physiological function to development of biotechnology to control the plant development and growth

游离N-聚糖生理功能的阐明及其在控制植物发育和生长的生物技术开发中的应用

• 批准号: 20K05959
• 负责人: 木村 吉伸
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K05959/
• 关键词: 遊離N-グリカン; PNGase; ENGase; タンパク質フォールディング; オーキシン; 細胞質PNGase; 酸性aPNGase; 糖鎖機能; 酸性aPNGase); ENGase); 小胞体関連分解（ERAD）; Arabidopsis thaliana; free N-glycan; plant oligosaccharide

小胞体中で生じたミスフォールド糖タンパク質は，細胞質に逆輸送され小胞体関連分解を受ける。ミスフォード糖タンパク質は，プロテアソーム分解に先立ちcytosolic PNGase による脱グリコシル化を受け，還元末端側にキトビオースを有するハイマンノース型遊離N-グリカン (GN2-HMT-FNGs) が生成し，次いでENGaseの作用により還元末端にGlcNAc１残基を有するGN1-HMT-FNGsがμM濃度で蓄積する。一方，細胞外液中には acidic PNGase により生成すると考えられる複合型遊離N-グリカン（GN2-PCT-FNGs）が存在する。植物の分化成長に関わるこれらFNGsの機能解明研究の一環として，令和4年度には分化成長中の植物細胞質及び細胞外液に存在するハイマンノース型及び複合型FNGsとオーキシン（インドール酢酸, IAA）と相互作用特性について，IAAの蛍光強度変動を指標として詳細な解析を行った。その結果，GN2-HMT及びGN2-PCT-FNGs は共に，数ミリモル濃度で濃度依存的にIAAの蛍光強度を低下させることが明らかとなり，これら植物に遍在するFNGsと相互作用することを明らかした。その一方で，GN1-FNGsはIAAとの相互作用がGN2-FNGsに比べて有意に低下することが分かった。しかしながら，N-アセチルキトオリゴ糖ではIAAとの相互作用は観察されないため，コアマンノシル構造と還元末端のN-アセチルキトビオース構造の両者がIAAとの相互作用に必要であることが明らかになった。既にトマト導管水中にGN2-PCT-FNGsが存在することを明らかにしているが，令和４年度には，師管液採取が容易なキョウチクトウの新茎を用いて，師管水中にもGN2-PCT-FNGsが存在することを明らかにした。

内质网中产生的错误折叠的糖蛋白被转运回细胞质并经历内质网相关的降解。在蛋白酶体降解之前，Misford 糖蛋白通过胞质 PNGase 进行去糖基化，生成还原端具有壳二糖的高甘露糖型游离 N-聚糖 (GN2-HMT-FNG)，然后通过 GN1-HMT- 的作用将其还原。末端带有 GlcNAc1 残基的 FNG 以 μM 浓度积累。另一方面，复杂的游离 N-聚糖 (GN2-PCT-FNG) 被认为是由酸性 PNGase 产生的，存在于细胞外液中。作为阐明这些 FNG 在植物分化和生长中的功能的研究的一部分，2020 年，我们研究了分化过程中植物细胞质和细胞外液中存在的高甘露糖型和复合 FNG 和生长素（吲哚乙酸，IAA）我们以 IAA 荧光强度波动为指标，对相互作用特征进行了详细分析。结果表明，GN2-HMT 和 GN2-PCT-FNG 在几毫摩尔浓度下均以浓度依赖性方式降低 IAA 的荧光强度，表明它们与植物中普遍存在的 FNG 相互作用。另一方面，发现 GN1-FNG 与 IAA 的相互作用显着低于 GN2-FNG。然而，由于没有观察到 N-乙酰壳寡糖与 IAA 的相互作用，因此很明显，核心甘露糖基结构和还原端的 N-乙酰壳二糖结构都是与 IAA 相互作用所必需的。此前已经揭示了番茄导管水中存在GN2-PCT-FNGs，但在2020年度，GN2-PCT-FNGs的存在被揭示。

项目成果

植物細胞質ペプチド：N-グリカナーゼ(cPNGase)のin vitroでの活性測定系の構築

植物细胞质肽N-聚糖酶（cPNGase）体外活性测定系统的构建

• 发表时间: 2021
• 作者: 白井佐保子;上村亮太;秋山剛;前田恵;梶浦裕之;三崎亮;藤山和仁;木村吉伸
• 通讯作者: 木村吉伸

Improved Method for Preparation and Purification of Recombinant α-synuclein: High-mannose-type Free N-glycan 24 Prepared from an Edible Bean （Vigna angulari, Azuki bean） Inhibits α-synuclein Aggregation.

重组 α-突触核蛋白的制备和纯化的改进方法：从食用豆（绿豆、小豆）制备的高甘露糖型游离 N-聚糖 24 抑制 α-突触核蛋白聚集。

• DOI: 10.1093/bbb/zbac040
• 发表时间: 2022
• 作者: Kosaka; S.; Katsube; M.; Maeda; M.;Kimura; Y.
• 通讯作者: Y.

酸性 PNGase/細胞質 PNGase 欠損 Arabidopsis thaliana の遊離糖鎖構造解析

酸性 PNGase/细胞质 PNGase 缺陷拟南芥中游离糖链的结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 奥村 陸;白井佐保子;前田 恵;梶浦裕之;三﨑 亮;藤山和仁;木村吉伸
• 通讯作者: 木村吉伸

Construction of Tomato Plants with Suppressed Endo-β-N-acetylglucosaminidase Activity Using CRISPR-Cas9 Mediated Genome Editing.

使用 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑构建内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性受到抑制的番茄植株。

• DOI: 10.1016/j.plaphy.2022.08.009
• 发表时间: 2022
• 作者: Okamoto; N.; Maeda; M.; Yamamoto; C.; Kodama; R.; Sugimoto; K.; Shinozaki; Y.; Ezura; H.;Kimura; Y
• 通讯作者: Y

Cytosolic free N-glycans are retro-transported into the ER in plant cells

胞质游离 N-聚糖被逆向转运至植物细胞的内质网

• DOI: 10.3389/fpls.2020.610124
• 发表时间: 2021
• 影响因子: 5.6
• 作者: Makoto Katsube; Natsuki Ebara; Megumi Maeda;Yoshinobu Kimura
• 通讯作者: Yoshinobu Kimura