一酸化窒素還元酵素反応中間体の動的構造解析による触媒反応機構の解明

通过一氧化氮还原酶反应中间体的动态结构分析阐明催化反应机理

• 批准号: 19J15471
• 负责人: 武田 英恵
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: University of Hyogo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J15471/
• 关键词: 金属酵素; ヘムタンパク質; 反応機構

本年度は、一酸化窒素還元酵素（NOR）のLCP結晶にケージドNOとケージド電子を浸潤させ、時間分解SFXシリアルフェムト秒X戦結晶構造解析）のための２段階励起システムを構築する予定であった。しかし、この方法では結晶の還元状態を保つことは困難であったため、LCP結晶の結晶化方法の再検討を行った。当初予定していたインジェクターからLCP結晶を結晶化媒体とともに流す手法から、サンドイッチ法によって薄いフィルムの間でLCP結晶化を行い、その結晶をフィルムのままX線結晶構造解析を行う手法へと変更した。この手法を用いれば、結晶の気密性を保つことが出来るためケージド電子を使わなくても、還元型NORの結晶を作りケージドNOを浸潤させそこへ従来のように紫外光を手法を使うことが可能となる。この手法を実現するため、極力酸素を透過しないフィルムの間に嫌気状態（グローブボックス内）で溶液状態の還元型NORを挟み、好気条件にてどの程度NORの還元状態を保持できるかを確認した。その結果溶液状態において約６時間程度還元状態を保持できることが確認できた。本年度は、X線自由電子レーザ施設SACLAでの測定までに至らなかったが、次年度の測定に繋がる測定手法の変更および進展があった。また、本年度はNOR酵素反応中に現れる２種類のNO結合型反応中間体の同定にも取り組んだ。これまでに時間分解赤外吸収分光測定によって第一反応中間体についてはヘム鉄と非ヘム鉄で構成されたNORの活性中心において非ヘム鉄にNOが結合した状態であることは明らかに出来ていた。第二反応中間体については現在のところ同定には至っていない。そこで本年度より新しくEPR分光法を用いた反応中間体の捕捉を試みた。現在、EPR分光法を用いて既に第一反応中間体の捕捉に成功しており、測定条件を検討することで第二反応中間体の捕捉もできると期待している。

在这个财政年度，计划为氮还原酶的LCP晶体（NOR）和Cageide电子入侵，并入侵了两个步骤的激发系统，并在时间分解时构建了两个步骤激发系统。战争晶体结构分析）。但是，在这种方法中很难维持晶体的还原状态，因此回顾了LCP晶体的结晶方法。从最初计划的注射器以结晶培养基流动LCP晶体，三明治方法在薄膜之间进行了LCP结晶，并将晶体更改为X射线晶体结构分析。使用这种技术，您可以保持晶体的气密性，因此，即使您不使用Cage de Electron，也可以创建一个还原型晶体，侵入Cageide No，并像以前一样使用紫外线。为了实现这种方法，请检查多少也不能保持在规范的条件下，将溶液还原类型夹住，也可以在不会尽可能多地传输氧气的状态（在手套箱中）。结果，可以确认在溶液状态下可以维持返回状态约6小时。在这个财政年度，不可能在无X射线的电子激光设施Sacla上进行测量，但是测量方法的变化和进度导致了下一个财政年度的测量。在这个财政年度，我们致力于确定出现在NOR酶反应中的两种NO类型的反应中间体。显然，第一个反应中间体是一个状态，其中第一个反应中间体已与非血红素铁结合在一起，该状态由血红素铁和非血红素铁组成，这是由于时间分解红外吸收而导致的。第二个反应中间体尚未鉴定。因此，我们尝试使用今年的EPR光谱法捕获反应中间体。当前，我们已经成功地使用EPR照明方法捕获了第一个反应中间体，我们希望可以考虑测量条件以捕获第二个反应中间体。

项目成果

NO-binding and protonation process in the catalytic reaction of the bacterial nitric oxide reductase as established by time-resolved spectroscopic method

时间分辨光谱法建立细菌一氧化氮还原酶催化反应中的NO结合和质子化过程

• 发表时间: 2019
• 作者: Hanae Takeda;Tatsunari Kimura;Takashi Nomura;Masaki Horitani;Azusa Yokota;Akiko Matsubayashi;Shoko Ishii;Yoshitsugu Shiro;Minoru Kubo and Takehiko Tosha;Hanae Takeda;Hanae Takeda
• 通讯作者: Hanae Takeda

15th International Symposium on Applied Bioinorganic Chemistry

第十五届应用生物无机化学国际研讨会

• 发表时间: 2019

Timing of NO Binding and Protonation in the Catalytic Reaction of Bacterial Nitric Oxide Reductase as Established by Time-Resolved Spectroscopy.

通过时间分辨光谱确定细菌一氧化氮还原酶催化反应中 NO 结合和质子化的时间。

• DOI: 10.1246/bcsj.20200038
• 发表时间: 2020
• 期刊: Bulletin of the Chemical Society of Japan
• 影响因子: 4
• 作者: Hanae Takeda;Tatsunari Kimura;Takashi Nomura;Masaki Horitani;Azusa Yokota;Akiko Matsubayashi;Shoko Ishii;Yoshitsugu Shiro;Minoru Kubo and Takehiko Tosha
• 通讯作者: Minoru Kubo and Takehiko Tosha

NO-binding and protonation process in the catalytic reaction of heme/non-heme iron nitric oxide reductase by time-resolved spectroscopic methods

时间分辨光谱法研究血红素/非血红素一氧化氮还原酶催化反应中的NO结合和质子化过程

• 发表时间: 2019
• 作者: Hanae Takeda;Tatsunari Kimura;Takashi Nomura;Masaki Horitani;Azusa Yokota;Akiko Matsubayashi;Shoko Ishii;Yoshitsugu Shiro;Minoru Kubo and Takehiko Tosha;Hanae Takeda
• 通讯作者: Hanae Takeda