Functional analysis of bioactive ingredients from Miso

味噌生物活性成分的功能分析

基本信息

批准号：
19J14971
负责人：
中村文彬
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

味噌からエピゲノムを指標とした生理活性成分の探索により、抗ストレス活性成分フェルラ酸エチルエステル（FAEE）を明らかにしたが、本成分の作用メカニズムは知られていない。低分子化合物の作用メカニズム解明へのアプローチは様々あるが、エピゲノム調節は酵素だけでなく、様々な補酵素や補因子など数多くの制御因子によって巧妙に制御されているため、FAEEによる直接の標的分子を同定することはメカニズムを理解する上で重要となる。そこで本研究では、FAEEの標的分子および標的遺伝子領域を明らかにすることでFAEEの作用メカニズムの解明を目指している。本年度はマウスES細胞から分化誘導した神経幹細胞からのFAEE標的分子候補の探索を行った。令和一年度に合成したFAEEのプローブ分子を用いて、標的分子のプルダウン実験を行った結果、FAEE結合ビーズに特異的なバンドが複数得られた。バンドについてはLC-MS/MSによるアミノ酸配列解析によって候補タンパク質を明らかにしており、現在、その標的分子候補をターゲットとしたshRNAベクターを作製およびノックダウン細胞におけるフェノタイプを確認している。また、FAEEの神経分化誘導作用機構を遺伝子発現変化の面から推察するため、FAEEで処理した神経幹細胞からcDNAの調製を行い、RNA-seqを用いた網羅的遺伝子発現解析を行った。FAEE処理によりcontrolと比べて転写量が1.5倍以上に上昇もしくは低下したタンパク質をコードしている遺伝子がそれぞれ24ずつ得られた。また、転写量が2倍以上に変化した114のノンコーディングRNAを得た。これらの遺伝子について、real-time PCRによる遺伝子発現量の確認を行うとともに、神経分化誘導作用との関係性を検証している。

通过以表观基因组为指标寻找味噌中的生理活性成分，我们发现了抗应激活性成分阿魏酸乙酯（FAEE），但该成分的作用机制尚不清楚。阐明低分子量化合物的作用机制有多种方法，但由于表观基因组调控不仅受到酶的巧妙控制，还受到各种辅酶和辅因子等多种调控因子的巧妙控制，因此很难直接靶向分子FAEE 识别对于理解该机制很重要。因此，在本研究中，我们旨在通过鉴定FAEE的靶分子和靶基因区域来阐明FAEE的作用机制。今年，我们从小鼠 ES 细胞诱导分化的神经干细胞中寻找候选 FAEE 靶分子。使用2021年合成的FAEE探针分子对目标分子进行下拉实验，获得了多个FAEE结合珠特异的条带。我们通过LC-MS/MS的氨基酸序列分析鉴定了条带的候选蛋白，目前正在构建针对候选靶分子的shRNA载体并确认敲低细胞中的表型。此外，为了从基因表达变化的角度推断FAEE诱导神经分化的作用机制，我们从经FAEE处理的神经干细胞中制备了cDNA，并使用RNA-seq进行了全面的基因表达分析。作为FAEE处理的结果，获得了24个编码蛋白质的基因，其转录水平与对照相比增加或减少了1.5倍或更多。我们还获得了 114 个非编码 RNA，其转录水平增加了一倍或更多。对于这些基因，我们正在通过实时PCR确认基因表达水平，并验证它们与神经分化诱导作用的关系。