オートファジー必須因子ＶＭＰ１のＸ線結晶構造解析

自噬必需因子VMP1的X射线晶体结构分析

• 批准号: 19J13421
• 负责人: 井爪 珠希
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J13421/
• 关键词: オートファジー; 構造解析

本研究はオートファジーの初期過程に必須であるVMP1の立体構造を明らかにすることで、VMP1のオートファジーへ果たす役割を解明することを目的としている。申請者は申請時点でVMP1単体およびパートナータンパク質であるTMEM41Bとの複合体の発現および精製に成功していた。申請以降、共同研究先とともにVMP1およびTMEM41Bが複合体を形成することを確かめた。この研究成果を含む内容はJ. Cell Biol.に掲載された。また、前年度ではVMP1およびTMEM41Bの複合体のクライオ電顕による単粒子解析を行い、予備的なデータを得ることに成功した。しかしながら、VMP1およびTMEM41Bの複合体は分子量が小さいうえに細胞外ドメインが小さいために、二者複合体ではクライオ電顕による残基レベルでの構造決定は困難であった。そこで、本年度はVMP1に特異的に結合する抗体を用いて、抗体、VMP1、TMEM41Bの三者複合体のクライオ電顕による構造解析を目指した。VMP1のモノクローナル抗体は市販されていないため、共同研究先とともに界面活性剤下でVMP1と安定して結合可能な抗体を選定した。今後この抗体、VMP1およびTMEM41Bの三者複合体の立体構造解析を目指し、精製条件の検討およびクライオ電顕による撮影を試みる。撮影に成功した場合は、VMP1およびTMEM41Bの機能の解明に向けて、機能および構造既知のタンパク質と構造比較を行い得られた仮説のもと機能解析を行う。

这项研究旨在通过阐明VMP1的三维结构来阐明VMP1在自噬中的作用，这对于自噬的初始过程至关重要。在应用时，申请人单独用VMP1和伴侣蛋白TMEM41B成功表达并纯化了复合物。自应用程序以来，已经确认VMP1和TMEM41B以及联合研究人员形成了复杂的复合物。包括此研究结果在内的内容发表在J. Cell Biol中。在上一年，我们使用VMP1和TMEM41B复合物的冷冻电子显微镜进行了单个粒子分析，并成功获得了初步数据。但是，由于VMP1和TMEM41B的络合物具有较小的分子量和较小的细胞外域，因此很难通过两部分配合物中的冷冻电子显微镜确定残基水平的结构。因此，今年，我们旨在使用特异性结合VMP1的抗体，使用冷冻电子显微镜分析抗体，VMP1和TMEM41B的三方复合物的结构方面。由于在商业上没有用于VMP1的单克隆抗体，因此我们选择了一种抗体，该抗体与联合研究人员一起在表面活性剂下与VMP1稳定结合。将来，我们将旨在分析抗体VMP1和TMEM41B的三方复合物的三维构象，并将尝试研究纯化条件并使用冷冻电子显微镜拍摄它们。如果拍摄成功，则通过比较功能性和结构化蛋白来阐明VMP1和TMEM41B的功能来基于获得的假设进行功能分析。