Identification of possible factors that regulate Doublesex-independent sexual differentiation which was newly found in the lepidopteran insect

鉴定在鳞翅目昆虫中新发现的调节双性独立性分化的可能因素

基本信息

批准号：
19J10346
负责人：
笠原良太
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

1.前年度に確認されたBmdmrt11E変異雌における成熟卵の脂質含量低下についてRNA-seqデータ解析による責任遺伝子探索を行い、Bmdmrt11Eの下流として働く可能性の高い9遺伝子を同定した。中でも卵巣で最も高い発現を示したCi-13という遺伝子を最有力候補とした。さらに、変異雌の卵と正常雌の卵からタンパク質を抽出し、SDS-PAGEによってタンパク質の組成を解析した。すると、変異雌の卵では卵黄タンパク質であるESPsの分解産物と予想されるタンパク質の蓄積が見られた。このESPsは機能不明タンパク質だが、先行研究から脂質結合能が予想され卵内の脂質保持を行うと考えられてきた。加えて、ESPsは胚発生期で分解を受けるが、その分解はCi-13のようなキモトリプシンインヒビターによって受精まで抑制されていることがわかっていた。以上から、Bmdmrt11E 変異体では卵内でCi-13量が減少してESPsが異常に早期に分解を受けたために脂質を保持できなかったものと結論づけた。2.BmDSXによるBmdmrt93Bの制御について、前年度に同定したBmDSX結合配列に着目して実験を行った。まずは抗DSX抗体を用いたChIP-qPCRによって当該領域へのBmDSXの結合を調査したが、条件検討が難航し採用期間中に結果を出せなかった。続いて、CRISPR/Cas9による当該配列の破壊を試みたがインジェクションを行った胚が孵化せず、こちらも結果を出せなかった。しかし、今年度新たに得られたBmdsx変異体の生殖巣を用いたRNA-seqデータの解析から、Bmdmrt93B は予想通りメスでのみBmDSXの制御(抑制)を受けていることがわかった。また、Bmdmrt93B 以外にもDoublesex非依存的性分化を担う可能性のある因子を多数発見し、将来的な研究の手がかりを得ることができた。

1。我们研究了上一年通过RNA-Seq数据分析证实的女性BMDMRT11E成熟卵的脂质含量降低，并确定了9个可能充当BMDMRT11E下游的基因。其中最有可能的候选者是卵巢中最高表达的基因CI-13。此外，从突变雌性卵和正常雌性卵中提取蛋白质，并通过SDS-PAGE分析蛋白质成分。这表明预测蛋白作为突变雌性卵中的ESP（蛋黄蛋白）的降解产物的积累。这些ESP是未知功能蛋白的蛋白质，但先前的研究已经预测了它们的脂质结合能力，并被认为保留在卵中的脂质。此外，ESP在胚胎发育过程中会降解，发现它们的降解被胰胆红素抑制剂（如CI-13）抑制为受精。从以上结论得出的结论是，BMDMRT11E突变体的卵中CI-13水平降低，导致ESP异常早期降解，而ESP无法保留脂质。 2。实验是针对BMDSX对BMDMRT93B调节的，重点是上一年确定的BMDSX结合序列。首先，我们使用抗DSX抗体研究了BMDSX与该区域的结合，但是有条件的研究很困难，在采用期间未获得结果。接下来，我们试图用CRISPR/CAS9破坏序列，但是注射的胚胎没有孵化，我们也无法产生结果。然而，今年使用新获得的BMDSX突变体的性腺对RNA-SEQ数据进行分析表明，BMDMRT93B仅在女性中仅受BMDSX对照（抑制）的影响，如所预期。除了BMDMRT93B外，我们还发现了许多其他可能导致Doublesex独立的性差异化的因素，为将来的研究提供了线索。