超解像イメージングを用いたＭｉｅａｐによるミトコンドリア品質管理機構の解析

Mieap超分辨率成像分析线粒体质量控制机制

• 批准号: 19J01579
• 负责人: 柴田 貴弘
• 金额: $ 3.08万
• 依托单位: National Cancer Center Japan
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J01579/
• 关键词: ミトコンドリア; リソソーム; イメージング

リソソームタンパク質であるCathepsin-Dの局在の変化を解析することで、MALMにおけるMieapの役割の解明を目的に以下の研究を行なった。①Mieapが存在しない条件におけるリソソームタンパク質の局在解析：LAMP1、Cathepsin-D、Cathepsin-Bの3つのリソソームタンパク質にGFPあるいはRFPの蛍光タンパク質を融合させ、ライブセルイメージング解析により、ミトコンドリアとの関係を解析した。その結果Mieap欠損細胞であるHeLa細胞でCathepsin-Dのミトコンドリア局在が確認された。また、mAppleの蛍光タンパク質を融合させたTOM20（ミトコンドリア外膜タンパク質）を発現させたところ、ミトコンドリア外膜を通過して内部に局在することが超解像イメージング解析により示唆された。②Mieapが存在する条件でのCathepsin-D局在解析：細胞がストレスを受ける状況において、MieapはCathepsin-Dをミトコンドリアへ移行させやすくする、と仮説を立てて立証を行った。Cathepsin-DにGFPを融合させたベクターとDsRed-mitoベクターを導入したHeLa細胞に対して、アデノウイルスを用いてMieap αを10MOI感染させて、IRを60Gy照射したところ、Cathepsin-Dがミトコンドリアに分布しやすくなる結果が得られた。①、②の結果から、Mieapの有無に関わらずリソソームタンパク質であるCathepsin-Dはミトコンドリアに移行するといった、特有でかつ未知の機能があることが推測された。MALMが生じる際には、ストレスを受けた細胞においてMieapがリソソームタンパク質をミトコンドリアに移行させている、と考えていたが、Cathepsin-Dに関してMieapは起爆剤ではなく、促進剤として作用することが考えられる。

我们进行了以下研究，旨在通过分析溶酶体蛋白组织蛋白酶-D 的定位变化来阐明 Mieap 在 MALM 中的作用。 ① 在没有Mieap的情况下进行溶酶体蛋白的定位分析：将GFP或RFP荧光蛋白与LAMP1、Cathepsin-D和Cathepsin-B这三种溶酶体蛋白融合，并通过活细胞成像分析分析它们与线粒体的关系。结果，在 HeLa 细胞（Mieap 缺陷细胞）中证实了组织蛋白酶-D 的线粒体定位。此外，当我们表达 TOM20（线粒体外膜蛋白）（一种融合的 mApple 荧光蛋白）时，超分辨率成像分析表明它穿过线粒体外膜并定位在线粒体内部。 (2)Mieap存在下组织蛋白酶-D的定位分析：我们假设并验证了Mieap在细胞处于压力的情况下促进组织蛋白酶-D向线粒体的转移。当用与GFP载体和DsRed-mito载体融合的Cathepsin-D转染的HeLa细胞用腺病毒感染10 MOI的Mieap α并用60 Gy的IR照射时，Cathepsin-D被转移至线粒体。更轻松。从①和②的结果推断，溶酶体蛋白Cathepsin-D具有独特且未知的功能，例如无论Mieap是否存在，都会转移到线粒体。当MALM发生时，人们认为Mieap将溶酶体蛋白易位至应激细胞中的线粒体，但对于组织蛋白酶-D，Mieap被认为是作为启动子而不是触发器来完成的。

项目成果

Mieap誘導性細胞死で形成される液胞の発生過程の検討

检查 Mieap 诱导的细胞死亡过程中形成的液泡的发育过程

• 发表时间: 2019
• 作者: 碇 直樹;中村 康之;柴田 貴弘;山本 雅一;荒川 博文
• 通讯作者: 荒川 博文