時空間的に内在性遺伝子を誘導する人工転写因子システムの開発
开发时空诱导内源基因的人工转录因子系统
基本信息
- 批准号:19J00883
- 负责人:
- 金额:$ 3.08万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for JSPS Fellows
- 财政年份:2019
- 资助国家:日本
- 起止时间:2019-04-25 至 2022-03-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
ヒートショック(HS)転写因子HSF1は通常ヒートショックタンパク質(HSP)と結合して細胞質に存在し非活性化状態であるが、HSにより核内に移行しHS応答配列を持つ遺伝子群を活性化する。この原理を利用し、HSを与えた細胞でのみHSF1を核移行させ、SAMシステムを介して核内のdCas9-sgRNAに結合・集積することにより標的遺伝子の転写を活性化するシステムの開発を試みた。ヒト培養細胞を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイの結果、MCP-マウスHSF1(mHSF1)を導入することで1.9倍の活性上昇が見られた。MCP-mHSF1依存的な転写活性化はHSなしの実験群でも見られたが、抗MCP抗体による免疫染色を行なったところ、HEK293T細胞においてはMCP-mHSF1がHS非依存的に核移行している様子が観察され、培養細胞においては条件によりHSF1の核細胞質局在が変化する問題が生じた。したがってMCP-mHSF1の集積による標的遺伝子の転写活性化には成功したが、最適化のための更なる検証にはin vivoの系の必要性が示された。そのためCRISPRを用いたより簡便な新規のトランスジェニック(Tg)手法の開発に着手し、複数の両生類Tgの作製に成功した。さらに光学系により時空間的に細胞のアブレーションが可能なイモリTgラインを樹立し、生殖系列への移行も確認した。開発した手法により人工転写因子の評価のためのTgラインの作製が容易となり、in vivoでのシステムの評価系が作製可能となった時点で研究を終了した。
热休克 (HS) 转录因子 HSF1 通常以非活性状态与热休克蛋白 (HSP) 结合存在于细胞质中,但在 HS 发生后,它会转位到细胞核中并激活一组包含 HS 反应元件的基因。利用这一原理,我们尝试开发一种系统,通过仅在给予 HS 的细胞中将 HSF1 转位到细胞核,并通过 SAM 系统在细胞核中结合和积累 dCas9-sgRNA。使用培养的人类细胞进行荧光素酶报告基因测定,结果发现,通过引入 MCP 小鼠 HSF1 (mHSF1),活性增加了 1.9 倍。在没有 HS 的实验组中也观察到 MCP-mHSF1 依赖性转录激活,但抗 MCP 抗体的免疫染色表明,在培养的 HEK293T 细胞中,MCP-mHSF1 以不依赖 HS 的方式转位至细胞核。在细胞中,HSF1 的核细胞质定位根据条件而变化。因此,虽然我们通过积累MCP-mHSF1成功激活了靶基因转录,但我们证明需要体内系统来进一步验证优化。因此,我们开始利用CRISPR开发一种新的、更简单的转基因(Tg)方法,并成功创造了多种两栖动物Tg。此外,我们建立了一种蝾螈Tg系,可以使用光学系统在时空上进行细胞消融,并证实了向种系的转变。所开发的方法可以轻松创建用于评估人工转录因子的 Tg 系,并且当可以创建体内评估系统时,研究结束。
项目成果
期刊论文数量(7)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Functional analysis for deciphering unique genetic program in newt limb regeneration
破译蝾螈肢体再生独特遗传程序的功能分析
- DOI:
- 发表时间:2019
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:Suzuki M;Suzuki KT
- 通讯作者:Suzuki KT
イモリの再生能力の謎に迫る遺伝子カタログの作成 ~新規の器官再生研究モデル生物イベリアトゲイモリ~
创建接近蝾螈再生能力之谜的基因目录 - 器官再生研究的新模式生物伊比利亚网状生物 -
- DOI:
- 发表时间:
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:
- 通讯作者:
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CLiCKAR:用于实用基因分型和评估基于 CRISPR-Cas9 的敲除表型的网络工具
- DOI:
- 发表时间:2019
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:Iida M;Suzuki M;Sakane Y;Nishide H;Uchiyama I;Yamamoto T;Suzuki KT;Fujii S
- 通讯作者:Fujii S
Crispant:両生類における遺伝子機能解析「実験医学別冊ゲノム編集実験スタンダード」
Crispant:两栖动物基因功能分析《实验医学专版基因组编辑实验标准》
- DOI:
- 发表时间:2019
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:鈴木賢一;鈴木美有紀;林利憲
- 通讯作者:林利憲
A comprehensive reference transcriptome resource for the Iberian ribbed newt Pleurodeles waltl, an emerging model for developmental and regeneration biology
- DOI:10.1093/dnares/dsz003
- 发表时间:2018-09
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:M. Matsunami;Miyuki Suzuki;Yoshikazu Haramoto;A. Fukui;Takeshi Inoue;K. Yamaguchi;I. Uchiyama;Kazuki Mori;K. Tashiro;Yuzuru Ito;T. Takeuchi;Ken-ichi T. Suzuki;K. Agata;S. Shigenobu;Toshinori Hayashi
- 通讯作者:M. Matsunami;Miyuki Suzuki;Yoshikazu Haramoto;A. Fukui;Takeshi Inoue;K. Yamaguchi;I. Uchiyama;Kazuki Mori;K. Tashiro;Yuzuru Ito;T. Takeuchi;Ken-ichi T. Suzuki;K. Agata;S. Shigenobu;Toshinori Hayashi
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鈴木 美有紀其他文献
Transcriptome resource for Pleurodeles waltl: Next-generation model species for comparative studies in developmental biology and regeneration research with vertebrate model animals
Pleurodeles waltl 转录组资源:用于与脊椎动物模型动物进行发育生物学和再生研究比较研究的下一代模型物种
- DOI:
- 发表时间:
2018 - 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:
松波 雅俊;鈴木 美有紀;原本 悦和;福井 彰雅;井上 武;山口 勝司;内山 郁夫;森 一樹;田代 康介;伊藤 弓弦;竹内 隆;鈴木 賢一;阿形 清和;重信 秀治;林 利憲 - 通讯作者:
林 利憲
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- 批准号:
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- 资助金额:
$ 3.08万 - 项目类别:
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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$ 3.08万 - 项目类别:
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- 资助金额:
$ 3.08万 - 项目类别:
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- 资助金额:
$ 3.08万 - 项目类别:
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- 资助金额:
$ 3.08万 - 项目类别:
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists