Molecular analysis of mirror-arabinan present in cell wall polysaccharides of Mycobacteria and its degrading enzymes

分枝杆菌细胞壁多糖及其降解酶中镜像阿拉伯聚糖的分子分析

基本信息

批准号：
19H00929
负责人：
伏信進矢
金额：
$ 28.95万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19H00929/
关键词：
糖質関連酵素結核菌アラビノース阻害剤可視化ツール

项目摘要

鏡像体アラビナン分解酵素のうち、２種類のEndo型酵素(EndoMA1, EndoMA2)と2種類のExo型酵素(ExoMA1, ExoMA2)の機能解析と、結晶構造解析を進めた。その際、新たに有機合成した基質アナログの有効性が示された。さらに、EndoMA1の結晶構造で発見した新規CBMの金属ナノ粒子(GNP)を用いた解析に着手した。EndoMA1とEndoMA2の基質特異性解析を合成基質を用いて行った。これまで合成に成功していた22糖(A22BβT)に加え、3種類の合成オリゴ糖(A9LT, A8BT, A5BT)を基質として、HPAEC-PADとHPLCを用いた解析により、両酵素の詳細な基質特異性を明らかにすることができた。EndoMA1はEndoMA2より小さなフラグメントを生成すること、EndoMA2は分岐の隣の結合を切断できること、などが分かった。昨年度発見したExoMA2(MA1061)の酵素学的性質や基質特異性も合成基質を用いて詳細に明らかにした。結晶構造解析では、EndoMA1のA9LTとの複合体構造決定に成功した。これにより触媒ドメインの基質認識と触媒機構が明らかになった。EndoMA1の触媒残基はAsp33(求核触媒)とAsp51(酸/塩基触媒)であることが、結晶構造と変異体解析により示された。さらに、C末端側のβ-サンドイッチドメインにD-アラビナンのオリゴ糖が結合していたことから、このドメインが新規な炭水化物結合モジュール(CBM)であることが示唆された。これまでの検討により、EndoMA1を用いて処理したD-アラビナンを結合させたGNPが有効であることが分かっていた。部分分解D-アラビナン結合型GNPを用いたところ、野生型EndoMA1および触媒残基変異体(D51N)が明確な凝集活性を示したことから、CBMが機能することにより多価の結合が起こっていることが示唆された。

在对映体阿拉伯聚糖降解酶中，我们对两种内型酶（EndoMA1、EndoMA2）和两种外型酶（ExoMA1、ExoMA2）进行了功能分析和晶体结构分析。当时，新有机合成的底物类似物的有效性得到了证明。此外，我们开始使用在 EndoMA1 晶体结构中发现的新 CBM 的金属纳米颗粒 (GNP) 进行分析。使用合成底物进行 EndoMA1 和 EndoMA2 的底物特异性分析。除了迄今为止已成功合成的22-糖（A22BβT）之外，还使用三种类型的合成寡糖（A9LT、A8BT、A5BT）作为底物，并使用HPAEC-PAD和HPLC进行分析，揭示了两种酶的详细底物我们能够澄清具体情况。他们发现 EndoMA1 生成的片段比 EndoMA2 更小，并且 EndoMA2 可以裂解分支旁边的键。去年发现的ExoMA2（MA1061）的酶性质和底物特异性也通过合成底物得到了详细阐明。在晶体结构分析中，我们成功地确定了EndoMA1与A9LT的复杂结构。这揭示了催化结构域的底物识别和催化机制。晶体结构和突变体分析表明EndoMA1的催化残基是Asp33（亲核催化剂）和Asp51（酸/碱催化剂）。此外，由于 D-阿拉伯寡糖与 C 端 β-夹心结构域结合，因此该结构域被认为是一种新型碳水化合物结合模块 (CBM)。先前的研究表明，用 EndoMA1 处理的与 D-阿拉伯聚糖结合的 GNP 是有效的。当使用部分降解的D-阿拉伯聚糖结合的GNP时，野生型EndoMA1和催化残基突变体(D51N)表现出明显的聚集活性，表明由于CBM的功能而发生多价结合。