モジュール型ポリケチド合成酵素の全体構造とドメイン間相互作用の解明

阐明模块化聚酮合酶的整体结构和域间相互作用

• 批准号: 20J13080
• 负责人: 千菅 太一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J13080/
• 关键词: ポリケチド合成酵素; 天然物生合成; タンパク質間相互作用; クロスリンク; 結晶構造解析; 単粒子解析

本研究はmodular型ポリケチド合成酵素 (PKS) のmodule全体構造の解明とその触媒ドメイン-アシルキャリアータンパク質 (ACP) ドメイン間の相互作用の解明を目的とする。本年度では”module全体構造の解明”を目指し、ケト合成酵素様脱炭酸酵素 (KSQ) ドメインを含むloading moduleの機能構造解析に着手した。KSQドメインはマロニル-ACPの脱炭酸反応を触媒することが予想されるがその機能解析例はなかったため、Streptomyces graminofaciens A-8890が生産する抗生物質FD-891の生合成に関わるPKS GfsAのloading module (KSQ -AT-ACP) を機能構造解析を行った。GfsA KSQドメインの機能解析に向け、その推定基質マロニル-GfsA ACPとの酵素反応を試みたところ脱炭酸活性を検出することができた。次にKSQドメインの脱炭酸反応の機構解明を目指し、GfsA KSQ-ATの2つのドメインからなるタンパク質のX線結晶構造解析を試みた。その結果、KSQドメインに基質を模したニトロアセチルパンテテインアミドが結合した複合体構造を決定することに成功した。この構造情報をもとにGfsA KSQドメインに対する部位特異的変異体解析を行い、その推定反応機構を提唱することができた (ACS Chem. Biol., 2022, 17, 198-206.)。続いて、loading module全体構造の解明に向けGfsA ACP=KSQ-AT複合体 (=; クロスリンクによる共有結合を介した複合体を意味する) の調製を試みた。検討の結果、パンテテインアミド型プローブを用いることでクロスリンク複合体を調製でき、その結晶化に成功した。今後X線結晶構造解析を試み、loading module全体構造の解明を目指す。

本研究的目的是阐明模块化聚酮合酶（PKS）模块的整体结构及其催化结构域与酰基载体蛋白（ACP）结构域之间的相互作用。今年，为了“阐明模块的整体结构”，我们开始对包含酮合酶样脱羧酶（KSQ）结构域的加载模块进行功能结构分析。 KSQ结构域预计能够催化丙二酰-ACP的脱羧反应，但尚未对此进行功能分析，因此我们鉴定了PKS GfsA的加载模块，该模块参与链霉菌产生的抗生素FD-891的生物合成分析了 gramaminofaciens A-8890 (KSQ -AT-ACP) 的功能结构。为了分析 GfsA KSQ 结构域的功能，我们尝试与其假定底物丙二酰基-GfsA ACP 进行酶促反应，并能够检测脱羧活性。接下来，我们尝试分析由两个结构域组成的蛋白质GfsA KSQ-AT的X射线晶体结构，旨在阐明KSQ结构域的脱羧机制。结果，他们成功确定了复合物的结构，其中模拟底物的硝基乙酰泛酰乙酰胺与 KSQ 结构域结合。基于这些结构信息，我们对 GfsA KSQ 结构域进行了位点特异性突变分析，并提出了其假定的反应机制 (ACS Chem. Biol., 2022, 17, 198-206.)。接下来，我们尝试制备GfsA ACP=KSQ-AT复合物（=指通过交联通过共价键合介导的复合物），以阐明负载模块的整体结构。研究结果是，我们能够使用泛酰胺探针制备交联复合物，并成功实现其结晶。未来，我们将尝试X射线晶体结构分析，旨在阐明装载模块的整体结构。

项目成果

I型ポリケチド合成酵素ローディングモジュールにおけるケト合成酵素様脱炭酸酵素の機能構造解析

I型聚酮合酶装载模块中酮合酶样脱羧酶的功能结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 千菅太一; 永井瑛; 宮永顕正; 工藤史貴; 江口正
• 通讯作者: 江口正

I型ポリケチド合成酵素ローディングモジュールにおけるケト合成酵素様脱炭酸酵素の機能構造解析

I型聚酮合酶装载模块中酮合酶样脱羧酶的功能结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 千菅太一; 永井瑛; 宮永顕正; 工藤史貴; 江口正
• 通讯作者: 江口正

I型ポリケチド合成酵素ローディングモジュールにおけるケト合成酵素様脱炭酸酵素の変異体解析

I型聚酮合成酶负载模块中酮合成酶样脱羧酶的突变分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 永井瑛; 千菅太一; 宮永顕正; 工藤史貴; 江口正
• 通讯作者: 江口正

I型ポリケチド合成酵素における同一モジュールのアシル基転移酵素とアシルキャリアタンパク質の相互作用解析

I型聚酮合酶同一模块中酰基转移酶与酰基载体蛋白的相互作用分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 伏見政人; 千菅太一; 宮永顕正; 工藤史貴; 江口正
• 通讯作者: 江口正

Structural Insight into the Reaction Mechanism of Ketosynthase-Like Decarboxylase in a Loading Module of Modular Polyketide Synthases

模块化聚酮化合物合成酶加载模块中酮合酶样脱羧酶反应机制的结构洞察

• DOI: 10.1021/acschembio.1c00856
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 4
• 作者: Chisuga Taichi;Nagai Akira;Miyanaga Akimasa;Goto Ena;Kishikawa Kosuke;Kudo Fumitaka;Eguchi Tadashi
• 通讯作者: Eguchi Tadashi