巨大蛋白質会合体ヘモシアニンを利用した汎用的な電子顕微鏡単粒子解析技術の開発

使用巨型蛋白聚集体血蓝蛋白开发通用电子显微镜单颗粒分析技术

基本信息

批准号：
20J10837
负责人：
橋本翼
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、大きく方針を変え、ヘモシアニンとは異なるＲＮＡ―タンパク質巨大分子複合体をスキャフォールドとして用いることを試みた。巨大分子中の複数箇所でゲスト分子との接続点となるＲＮＡ配列の挿入箇所を検討し、最適なスキャフォールド分子を設計した。また、設計したスキャフォールドには、複数のRNA結合タンパク質が結合することを生化学実験により明らかにした。これらの中から、３０ｋＤａ以下のクライオ電子顕微鏡単粒子解析で構造解析を行うには非常に小さいタンパク質をターゲットゲスト分子とし、実際に設計したスキャフォールド分子に結合させて単粒子解析を行った。収集したデータセットに対し、画像処理を試みたところ、通常の処理では結合点の柔軟性が課題となり、結合したゲスト分子を可視化することは叶わなかった。そこで、特定箇所に着目した画像処理を検討し、最終的に５－６オングストローム程度の分解能で、ゲスト分子の全体像を可視化したクライオ電顕マップを取得することに成功した。これは、決して高分解能での構造決定とは言えないものの、巨大なホスト分子と小さなゲスト分子とを接続するアプローチにより、クライオ電子顕微鏡単粒子解析による構造解析を可能にする可能性を十分に示す結果であると言える。今後は、今回得られた結果を基に、接続部位の改良・最適化を行うことで、より高分解能での構造解析を可能とするスキャフォールド分子の開発が期待される。

今年，我们显着改变了方法，尝试使用不同于血蓝蛋白的RNA-蛋白质大分子复合物作为支架。我们通过检查RNA序列的插入点来设计最佳的支架分子，这些插入点充当大分子中多个位置处的客体分子的连接点。此外，生化实验表明多种 RNA 结合蛋白与设计的支架结合。其中，使用30kDa以下的太小而无法通过冷冻电子显微镜单粒子分析进行结构分析的蛋白质作为目标客体分子，通过将其与实际设计的支架分子结合来进行单粒子分析。当尝试对收集的数据集进行图像处理时，由于正常处理中结合点的灵活性，不可能可视化结合的客体分子。因此，我们研究了针对特定位置的图像处理，最终成功获得了冷冻电镜图，该图以约5-6埃的分辨率可视化整个客体分子。虽然这不能说是高分辨率结构测定，但它充分证明了使用冷冻电子显微镜单粒子分析使用连接大主体分子和小客体分子的方法进行结构分析的可能性。这就是结果。未来，我们希望通过基于这次获得的结果改进和优化连接位点，我们将能够开发出能够实现更高分辨率结构分析的支架分子。