糸状菌の活性窒素ストレス応答・耐性化の分子機構の解明

阐明丝状真菌活性氮胁迫响应和耐受性的分子机制

基本信息

批准号：
20J00169
负责人：
門岡千尋
金额：
$ 2.58万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J00169/
关键词：
Aspergillus nidulans 一酸化窒素 GAPDH ストレス耐性

项目摘要

本研究は糸状菌の活性窒素ストレス応答・耐性化の分子機構の解明のために行った。モデル糸状菌Aspergillus nidulansにおいて、一酸化窒素（NO）曝露時の遺伝子発現変動についてRNA-Seqによって解析した結果、2313遺伝子の発現量が上昇し、1076遺伝子の発現量が低下することが明らかになった。これら発現上昇した遺伝子の中にA. nidulansのNO耐性に関与する遺伝子が存在すると推定し、解析を行った。本年度はNOストレスによって発現量が上昇することを見出した推定グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）をコードするgpdCについての解析を行った。まず、A.　nidulansにおいてgpdCの遺伝子破壊株を構築し、NOストレス耐性を比較した結果、gpdC破壊株はNOストレスに対して感受性を示した。また、細胞内GAPDH活性を測定した結果、NOストレス条件下のgpdC破壊株の細胞内GAPDH活性は野生株の約10%に低下したことから、GpdCはNOストレス条件下の細胞内GAPDH活性の維持に重要な役割を持つことが示唆された。次に、GpdCおよび、A. nidulansの主要なGAPDHであるGpdAの組換え酵素を発現・精製し、酵素活性レベルでのNO耐性を比較した結果、GpdAの活性はNO濃度に依存して劇的に低下したのに対し、GpdCの活性はGpdAと比較して緩やかに低下したことから、GpdCはNO耐性をもつGAPDHであることが示唆された。さらに、GpdCが保存されていない出芽酵母においてGpdCを異種発現させ、NO耐性を比較した結果、NO耐性が向上したことから、GpdCの発現によるNO耐性化への寄与は極めて高いことが示唆された。以上の結果から、GpdCはNOストレス条件下での解糖系代謝の亢進を通して、糸状菌のNO耐性に関与することが示唆された。

本研究旨在阐明丝状真菌活性氮胁迫响应和抗性的分子机制。在模型丝状真菌构巢曲霉中，对暴露于一氧化氮 (NO) 后基因表达变化的 RNA-Seq 分析表明，2313 个基因的表达水平增加，1076 个基因的表达水平下降。我们假设这些表达增加的基因中存在与构巢曲霉的NO抗性有关的基因，并进行了分析。今年，我们分析了 gpdC，它编码一种假定的甘油醛 3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)，发现 NO 胁迫会增加其表达水平。首先，我们构建了 gpdC 基因破坏的构巢曲霉菌株，并比较了它们对 NO 胁迫的抵抗力。结果，gpdC 破坏的菌株表现出对 NO 胁迫的敏感性。另外，测定细胞内GAPDH活性的结果显示，gpdC破坏株在NO胁迫条件下的细胞内GAPDH活性降低至野生型的约10％，表明GpdC在NO胁迫条件下维持了细胞内GAPDH活性。建议发挥重要作用。接下来，我们表达并纯化了构巢曲霉主要 GAPDH 的重组酶 GpdC 和 GpdA，并在酶活性水平上比较了 NO 耐受性，结果发现 GpdA 的活性显着依赖于 NO 浓度。，GpdC的活性下降速度比GpdA慢，表明GpdC是具有NO抗性的GAPDH。此外，我们在酿酒酵母中异源表达了GpdC，其中GpdC不保守，并比较了NO耐受性，结果表明GpdC表达对NO耐受性的贡献极高。这些结果表明，GpdC 通过在 NO 胁迫条件下增强糖酵解代谢来参与丝状真菌的 NO 耐受性。