高リスク型ゲノム構造によるゲノム蛋白群の動的集合と機能制御

高风险基因组结构对基因组蛋白的动态组装和功能控制

基本信息

批准号：
20K06560
负责人：
川上広宣
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tokyo University of Science, Yamaguchi
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、前任での研究の論文化に貢献するとともに（改稿版投稿中）。過去に報告した一本鎖DNA上での出芽酵母ORCの機能構造分化と制御(Kawakami et al., 2019, Genes Cells)をベースとして、更に発展させた。ORCは複製起点DNA二重鎖らせんの認識に必須な蛋白複合体であり、我々が最大サブユニットOrc1内に見いだしたモチーフeukaryotic origin sensor (EOS)は、基質DNAが二重らせんか一本鎖かによってORCの機能構造分化をもたらす(Kawakami et al., 2015, Sci. Rep.; Kawakami et al., 2019)。細胞内には一本鎖DNAを含め、二重らせんよりも高リスクとされる種々の非典型DNA構造が存在する。ORCの真正細菌オーソログDnaAにおいては、一本鎖DNAとの結合能の重要性が実験的に裏付けられている(Ozaki, Kawakami et al., 2008; Sakiyama, Kawakami et al., 2013)。一方、ORCの非典型DNA構造による制御の細胞内における役割や関与する染色体領域についての実験的証拠がない。そこで本年度は、これらの実験的証拠を得ることを志向して、出芽酵母細胞内におけるORCの特異的制御因子を重点的に探索することとした。昨年度開発した「ORC1機能を遺伝学的に亢進させるゲノム領域を簡便にスクリーニングするシステム」を用いて探索規模を拡大させたところ、従来は見逃していたスクリーニングの特異性の問題が判明した。更に改良を行い、スクリーニングの特異性を従来よりも上げることに成功した。併行して、異なる原理によって制御因子をスクリーニングするシステムの開発にも着手し、ORC1機能の制御に関わるゲノムクローンを見いだすことに成功した。今後、スクリーニングの規模を拡大しつつ、個別解析を進めることで、ORCと非典型DNA構造との連携に関わる証拠を得たい。併行して、昨年度の実績の論文発表にも着手している。

今年，我将把我之前的研究成果发表成一篇论文（目前正在提交修订版）。基于之前报道的酿酒酵母ORC对单链DNA的功能结构分化和调控（Kawakami et al., 2019, Genes Cells），我们进一步开发了这种方法。 ORC是一种蛋白质复合物，对于识别复制起点DNA双链螺旋至关重要，而我们在最大的亚基Orc1中发现的基序真核起源传感器（EOS）决定底物DNA是双螺旋还是单螺旋这导致 ORC 的功能和结构分化（Kawakami 等人，2015，Sci. Rep.；Kawakami 等人，2019）。细胞内存在多种非典型 DNA 结构，包括单链 DNA，它们被认为比双螺旋的风险更高。对于 ORC 的真细菌直系同源物 DnaA，其与单链 DNA 结合的能力的重要性已得到实验支持（Ozaki，Kawakami 等，2008；Sakiyama，Kawakami 等，2013）。另一方面，没有实验证据表明 ORC 通过非典型 DNA 结构或所涉及的染色体区域进行调节的细胞内作用。因此，今年，我们决定重点寻找酿酒酵母细胞中ORC的特异性调节因子，旨在为此获得实验证据。当我们使用去年开发的“可方便地筛选从基因上增强ORC1功能的基因组区域的系统”扩大搜索范围时，我们发现了以前被忽视的筛选特异性问题。通过进一步改进，与以前的方法相比，我们成功地提高了筛选的特异性。与此同时，我们开始开发一种采用不同原理筛选调控因子的系统，并成功找到了参与ORC1功能调控的基因组克隆。未来，我们希望通过扩大筛选规模和进行个体分析来获得ORC与非典型DNA结构之间合作的相关证据。与此同时，我们已经开始发表有关去年结果的论文。