Cell biological study for the distribution and dynamic of lipid in the biological membrane with nano-scale analyzing techniques

利用纳米级分析技术对生物膜中脂质的分布和动态进行细胞生物学研究

基本信息

批准号：
20H03154
负责人：
藤田秋一
金额：
$ 11.4万
依托单位：
Kagoshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞の自食作用（オートファジー）の内、特徴的な二重膜構造であるオートファゴソームを形成するマクロオートファジーにおいては、種々の遺伝的解析の結果、複数のオートファジー関連蛋白質(Atg)とその働きが解明されており、分子メカニズムの総合的な理解が進んでいる。しかしながらオートファゴソームの形成機序については不明な点がまだまだ多い。研究代表者らは現在までの検討により、酵母細胞においてオートファゴソームの形成にホスファチジルイノシトール4リン酸（PtdIns(4)P）の産生に関与するPI4キナーゼのPik1pが重要な役割を担っていることを解明した。また、PtdIns(4)Pはオートファゴソームの二重膜の内膜および外膜の管腔側のリーフレット（EF）に局在することを明らかにした。本研究ではPtdIns(4)Pの脱リン酸化するSac1pとSjl3pについてオートファゴソームの形成機序における関与を検討した。オートファジー活性を測定したところ、Sac1pとSjl3pの両方の活性を抑制した時のみオートファジーが抑制されていることを見出した。また、急速凍結割断レプリカ法を用いてオートファゴソームの構造を観察したところ、Sac1pとSjl3pの両方の活性を抑制した酵母細胞では、オートファゴソームが観察できなかった。そして、急速凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法によりPtdIns(4)Pを標識したところ、Sac1pあるいはSjl3pのどちらかを抑制した酵母細胞では、オートファゴソームの内膜および外膜ともに細胞質側のリーフレット（PF）にもPtdIns(4)Pが局在することがわかった。以上のことより、オートファゴソームの形成には、Pik1pによるPtdIns(4)Pの産生とSac1pとSjl3pによるPtdIns(4)Pの脱リン酸化の回転が正常に進むことが重要であることが示唆された。

在细胞自噬中，巨自噬形成具有特征性双膜结构的自噬体，通过各种遗传分析，发现其含有多种自噬相关蛋白（Atg），其功能已被阐明，并且对其分子的全面了解。机制不断进步。然而，自噬体的形成机制仍存在许多未知数。根据迄今为止的研究，主要研究人员发现 Pik1p（一种参与磷脂酰肌醇四磷酸 (PtdIns(4)P) 生成的 PI4 激酶）在酵母细胞中自噬体的形成中发挥着重要作用。。我们还发现 PtdIns(4)P 位于自噬体双层膜的内叶和外叶 (EF) 中。在本研究中，我们研究了使 PtdIns(4)P 去磷酸化的 Sac1p 和 Sjl3p 在自噬体形成机制中的参与情况。当我们测量自噬活性时，我们发现只有当 Sac1p 和 Sjl3p 活性都受到抑制时，自噬才会受到抑制。此外，当我们使用快速冷冻断裂复制法观察自噬体的结构时，我们发现在Sac1p和Sjl3p活性均被抑制的酵母细胞中观察不到自噬体。当我们使用快速冷冻断裂复制标记（QF-FRL）方法标记PtdIns（4）P时，我们发现在Sac1p或Sjl3p被抑制的酵母细胞中，自噬体的内膜和外膜都存在于Sac1p或Sjl3p被抑制的酵母细胞中。还发现 PtdIns(4)P 位于 (PF) 中。这些结果表明，Pik1p 产生的 PtdIns(4)P 以及 Sac1p 和 Sjl3p 进行的 PtdIns(4)P 去磷酸化的正常进展对于自噬体的形成非常重要。