Study on the mechanism of antibody transport to avian egg yolks by PLA2R receptor and its application to produce eggs rich in IgY

PLA2R受体将抗体转运至禽蛋黄的机制研究及其在生产富含IgY鸡蛋中的应用

基本信息

批准号：
20H03128
负责人：
村井篤嗣
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

・鳥類のPLA2Rは卵巣（=卵胞）に陥入する毛細血管の内皮細胞で発現することが推測された。そこで、組織学的な顕微鏡観察によりPLA2Rが発現する細胞を特定しようとした。ウズラの血管内皮細胞のマーカータンパク質に対する特異抗体（QH1）とPLA2Rに対する特異抗体を使って、ウズラの卵胞で両タンパク質が同一細胞に存在するかを調査した。・共焦点顕微鏡による観察により、ウズラの卵胞では、PLA2Rと血管内皮細胞マーカーが同一の細胞に共局在することが判明した。一部の細胞は、PLA2Rが発現するものの血管内皮細胞マーカーの発現が見られなかった。よって、血管内皮細胞以外にもPLA2Rは発現するものの、血管内皮細胞で発現するPLA2Rが卵黄へのIgY輸送に寄与する可能性が高いと考えられた。・PLA2RとIgYとの結合活性を測定するために、PLA2Rの組換えタンパク質を作出し、そのタンパク質を96wellプレート上に固定化することで、IgYとの結合活性を検出した。その結果、IgYは酸性条件下でPLA2Rと結合するが、中性条件下では結合しないことを確認した。そして、卵黄に大量に輸送されることが知られているIgY変異体はPLA2Rと強く結合するものの、卵黄への輸送量が少ないIgY変異体の多くはPLA2Rとの結合が弱いことが判明した。・卵黄に全く輸送されないIgY変異体の中には、逆にPLA2Rと強固に結合するものが存在した。・PLA2R欠損ウズラを作出するために、ウズラの受精卵にガイドRNAを発現するベクターを導入し、ゲノム編集が生じた個体をスクリーニングした。その結果、発生したウズラの中にPLA2R遺伝子の途中でゲノムDNAが切断されて遺伝子編集が生じた個体を確認した。同一の遺伝子編集が起こった個体同士を交配して、次世代のウズラでこの遺伝子編集を継承する個体を選抜する。

・推测鸟类的PLA2R在卵巢（卵泡）内陷的毛细血管的内皮细胞中表达。因此，我们试图通过组织学显微镜观察来鉴定表达PLA2R的细胞。使用针对鹌鹑血管内皮细胞 (QH1) 标记蛋白的特异性抗体和针对 PLA2R 的特异性抗体，我们研究了这两种蛋白是否存在于鹌鹑毛囊的同一细胞中。・共聚焦显微镜显示，PLA2R 和血管内皮细胞标记物共定位于鹌鹑毛囊的相同细胞中。尽管一些细胞表达PLA2R，但没有观察到血管内皮细胞标志物的表达。因此，尽管PLA2R在血管内皮细胞以外的细胞中表达，但认为在血管内皮细胞中表达的PLA2R可能有助于IgY向蛋黄的转运。・为了测定PLA2R和IgY之间的结合活性，我们制作了重组PLA2R蛋白，将该蛋白固定在96孔板上，并检测了与IgY的结合活性。结果，我们证实 IgY 在酸性条件下与 PLA2R 结合，但在中性条件下不结合。研究发现，已知大量转运至蛋黄的 IgY 突变体与 PLA2R 强烈结合，但许多少量转运至蛋黄的 IgY 突变体与 PLA2R 结合较弱。・在完全不被转运至蛋黄的IgY突变体中，还有与PLA2R牢固结合的其他突变体。・为了培育PLA2R缺陷型鹌鹑，我们将指导RNA表达载体导入到受精鹌鹑蛋中，并筛选发生基因组编辑的个体。结果，我们确认，在产生的鹌鹑中，有一些个体的基因组DNA在PLA2R基因的中间被切割，从而导致基因编辑。经过相同基因编辑的个体进行杂交，以选择将继承这种基因编辑的下一代鹌鹑。