Elucidation of the mechanism of DNA vaccine efficacy in fish

阐明 DNA 疫苗对鱼类的功效机制

基本信息

批准号：
20H03081
负责人：
高野倫一
金额：
$ 9.9万
依托单位：
Fisheries Research and Education Agency
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ギンブナに感染するラブドウイルスのCarp Haematopoietic Necrosis Virus（CHNV）をモデルとして、魚類でDNAワクチンが有効性を発揮するためのメカニズムを解明する。令和3年度までに、CHNVの全ゲノム配列を決定した。CHNVゲノム配列から予測したグリコ（G）プロテイン遺伝子またはヌクレオキャプシド(N)プロテイン遺伝子を挿入したDNAワクチン（順に、pcDNA-CHNVgまたはpcDNA-CHNVn)を作製し、それぞれをDNAワクチンとしてギンブナ筋肉に注射し免疫した。次いで、CHNVを腹腔内に注射し攻撃したところ、pCDNA-CHNVgで免疫した場合にはCHNV感染に対する防御効果が認められた。令和4年度は、DNAワクチンで免疫したギンブナの白血球を移植することで受動免疫が成立するかを確認した。pcDNA-CHNVgまたは対照のpcDNA6 V5-His A（空ベクター)を繰返し4回接種したギンブナを用意し、それぞれのDNAワクチンを接種した個体の腎臓白血球を別々に回収した。次いで、抗ギンブナCD8αモノクローナル抗体を用いたMagnetic-activated cell sorting (MACS)でCD8α陽性白血球（CD8+cells)とそれ以外の白血球（CD8-cells)を分画した。全白血球、CD8+ cellsまたはCD8- cellsをnaiveなOB1系統ギンブナに腹腔内注射で移植し、24時間後に致死量のCHNVウイルスを腹腔内接種した。その結果、pcDNA-CHNVg接種魚の全白血球またはCD8- cellsを移植した場合には累積死亡率が顕著に低下した。興味深いことに、pcDNA-CHNVgと空ベクター接種の何れにおいても、細胞傷害性T細胞が含まれると考えられるCD8+ cellsを移植した場合には60%以上の累積死亡率が観察された。このことから、pcDNA-CHNVgを接種したギンブナのCD8- cellsがCHNV感染防除に重要な役割を果たし、受動免疫を成立させると考えられた。

在这项研究中，我们将使用鲤鱼造血坏死病毒（CHNV）（一种感染蠹鱼的弹状病毒）作为模型来阐明 DNA 疫苗对鱼类有效的机制。到 2021 财年，我们已经确定了 CHNV 的整个基因组序列。制作插入了根据CHNV基因组序列预测的糖（G）蛋白基因或核衣壳（N）蛋白基因的DNA疫苗（按顺序为pcDNA-CHNVg或pcDNA-CHNVn），并将每种疫苗注射到受试者的肌肉中。蠹鱼作为 DNA 疫苗进行免疫。接下来，通过腹腔注射攻击CHNV，并在用pCDNA-CHNVg免疫时观察到对CHNV感染的保护作用。 2020年度，我们确认了是否可以通过移植DNA疫苗免疫过的日本鳕鱼的白细胞来建立被动免疫。准备用pcDNA-CHNVg或对照pcDNA6 V5-His A（空载体）重复接种四次的鸽子，并分别收集来自接种每种DNA疫苗的个体的肾白细胞。接下来，使用抗Ginbuna CD8α单克隆抗体通过磁激活细胞分选术（MACS）分离CD8α阳性白细胞（CD8+细胞）和其他白细胞（CD8-细胞）。将全白细胞、CD8+细胞或CD8-细胞腹膜内移植到幼稚OB1株银杏中，24小时后，腹膜内接种致死剂量的CHNV病毒。结果，当移植来自接种pcDNA-CHNVg的鱼的全白细胞或CD8细胞时，累积死亡率显着降低。有趣的是，对于 pcDNA-CHNVg 和空载体接种，当移植 CD8+ 细胞（被认为含有细胞毒性 T 细胞）时，观察到累积死亡率超过 60%。这表明接种pcDNA-CHNVg的日本松树的CD8-细胞在控制CHNV感染和建立被动免疫方面发挥重要作用。