Algal regulatory factors involved in maintenance mechanism for cell viabirity cooperating with autophagy

藻类调节因子参与细胞活力与自噬协同维持机制

基本信息

批准号：
20K05832
负责人：
梶川昌孝
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kindai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ハイスループットな変異株スクリーニングによる順遺伝学解析系が確立されたモデル緑藻クラミドモナスを活用し、植物界で先駆けて従来型のオートファジー因子とは異なる新奇な細胞生存を制御する分子機構の包括的な解明を目指している。本年は、表現型の緩やかなオートファジー変異体（atg9）への更なる変異導入により選抜されたN・S・Pのいずれの栄養欠乏条件においても生存性が親株よりも早期に低下する変異体21B1変異株の解析を進めた。昨年度までに、この変異体ではタンパク質リン酸化酵素遺伝子21B1に挿入変異を持つことを明らかにしている。野生型との交配により、ATG9への変異と21B1遺伝子の変異を分離した。21B1遺伝子にのみ変異をもつ子孫系統の生存率に関する表現型は、元の21B1変異株と同等であった。このことから、21B1変異株における生存率低下の表現型にはATG9の変異は寄与せず、もっぱら21B1遺伝子への変異によるものであることが示唆された。21B1遺伝子に蛍光タンパク質Venus遺伝子およびFLAGタグを連結したプラスミドを構築し、21B1遺伝子の単独変異体に導入したところ、表現型の回復とともにFLAG抗体を用いたウェスタン解析において予想サイズにシグナルが見られた。このシグナルの強度は栄養欠乏条件の切り替えの前後で変化しなかったことから、21B1タンパク質の発現レベルは栄養欠乏による制御は受けていないことが示唆された。細胞内のVenus由来蛍光パターンの観察により細胞内局在の推定を進めたところ、収縮胞において特異的なシグナルが見られたことから、21B1タンパク質は収縮胞に局在することが示唆された。一方で、リン酸化活性に必須と推定されるリジン残基をメチオニン置換した変異型21B1遺伝子を21B1遺伝子の単独変異体に導入した場合には、変異表現型を相補しない結果を得た。

这项研究利用了绿色藻类衣原体模型，该模型使用高通量突变型筛查建立了一个正向遗传分析系统，以全面阐明调节新细胞存活的分子机制，这与植物世界中的常规自噬因素不同。今年，我们对突变体21B1突变体进行了分析，其存活率在N.S.P的任何营养缺乏条件下，其生存率降低了，而N.S.P的任何营养缺乏条件是通过进一步突变中选择的慢速表型自噬突变体（ATG9）。到去年，已经揭示了该突变体在蛋白质磷酸酶基因21B1中带有插入突变。通过与野生型交配来分离对ATG9和21B1基因的突变。仅在21b1基因中具有突变的后代线的生存表型与原始的21B1突变体相当。这表明ATG9突变没有促进21b1突变菌株中降低存活率的表型，这主要是由于21B1基因的突变。构建了质粒，其中荧光蛋白金星基因和标志标签与21B1基因相关，并引入21B1基因的单个突变体中。随着表型的恢复，使用FLAG抗体的西方分析中的预测大小中发现了一个信号。该信号的强度在营养缺乏条件之间切换之前和之后没有变化，这表明21B1蛋白的表达水平不受营养缺乏控制。当我们通过观察细胞内细胞内衍生的荧光模式来预测亚细胞定位时，在收缩囊泡中发现了特定的信号，这表明21b1蛋白位于收缩囊泡上。另一方面，当被认为对磷酸化活性至关重要的赖氨酸残基的突变体21B1基因被引入21b1基因的单个突变体中，结果并不互补与突变体表型。