Multidimensional Analysis of operationally tolerance in living donor liver transplant patients

活体肝移植患者手术耐受性的多维度分析

基本信息

批准号：
20H00544
负责人：
奥村康
金额：
$ 29.62万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H00544/
关键词：
免疫寛容肝移植拒絶反応制御性T細胞移植免疫

项目摘要

肝生検サンプルを用いた多重蛍光免疫染色パネルの開発を行った。連携するピッツバーグ大学移植病理部で既に確立されている染色パネルを参考に、制御性T細胞と細胞傷害性T細胞の区別するパネル、線維化の進展を評価できるパネル、炎症性/抑制性マクロファージ(M1/M2)を評価できるパネルにおける分子ターゲットを検討し、抗体選定と染色の条件検討を実施した。肝生検の組織に発現するRNAシークエンスによる遺伝子解析と、浸潤するリンパ球をシングルセルでRNAシークエンス解析するために十分な検体量を検討し、生検針太さ(ゲージ)と必要な長さを決定した。また、多施設でのサンプリングのため、生検サンプルの遺伝子や細胞内の遺伝子の安定性を検討し、約12時間以内であれば、浸潤細胞のシングルセル解析をも実施可能であることが判明した。肝生検を用いずに潜在的な免疫拒絶反応を予測するリキッドバイオプシー法を検討した。これまでドナーリンパ球を用いた抗ドナー免疫応答性を評価するリンパ球刺激試験が主であったが、ドナーリンパ球の持続的な確保が困難な症例があり、ドナーリンパ球のうち、HLAクラス１とクラス２が十分に発現するB細胞に着目し、ドナーB細胞を拡大培養し、安定した抗原刺激ソースとして用いることを確立した。これにより、ドナー抗原に応答したT細胞の細胞分裂回数がCFSE染色を併用することで評価することが可能となり、今後免疫寛容に至った患者において実施できる。

我们使用肝活检样本开发了多重荧光免疫染色面板。基于匹兹堡大学附属移植病理学系已经建立的染色组，我们开发了一个区分调节性 T 细胞和细胞毒性 T 细胞的组、一个可以评估纤维化进展的组、以及一个可以评估纤维化进展的组。可以评估炎症/抑制性巨噬细胞（我们研究了可以评估 M1/M2 的面板中的分子靶标），并检查了抗体选择和染色条件。我们考虑了使用肝脏活检组织中表达的RNA测序和浸润淋巴细胞的单细胞RNA测序分析足以进行基因分析的样本量，并确定了活检针的厚度（规格）和所需长度。此外，由于在多个设施进行采样，我们检查了活检样本中的基因和细胞内基因的稳定性，发现浸润细胞的单细胞分析可以在大约 12 小时内完成。我们研究了一种液体活检方法，可以在不使用肝活检的情况下预测潜在的免疫排斥反应。迄今为止，淋巴细胞刺激试验主要是利用供体淋巴细胞来评价抗供体免疫反应性，但有时难以持续确保供体淋巴细胞，重点关注充分表达1类和2类的B细胞。我们扩增了供体 B 细胞，并确定它们可以用作抗原刺激的稳定来源。这使得通过使用CFSE染色来评估T细胞响应供体抗原的细胞分裂次数成为可能，这可以在未来出现免疫耐受的患者中进行。