Development of an adaptive evolution method for the creation of enzymes operable over a wide temperature range

开发适应性进化方法来创建可在宽温度范围内操作的酶

• 批准号: 20J00010
• 负责人: 佐藤 悠
• 金额: $ 3.08万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J00010/
• 关键词: 指向性進化; Kosmotoga; 酵素; 温度適応; 指向性進化法; 指向性進化; Kosmotoga; 酵素; 温度適応; 指向性進化法

本研究課題の目的は、従来トレード・オフの関係にある耐熱性と中低温での高い活性を両立する「広」温性酵素の新規創出法を開発することである。幅広い温度範囲において生育可能な広温菌を用いた酵素の指向性進化法により、宿主を変えることなく酵素の低温高活性化や耐熱化を可能にすることを目指した。当該年度は、Kosmotoga属やGeobacillus属をはじめとする広温菌の候補株を対象として、自律複製型及びゲノム組み込み型のプラスミドを用いた形質転換を試みた。安定した形質転換手法の確立には至っていないが、薬剤耐性を付与された複数の形質転換体を取得しており、現在解析を進めている。また、当初予定していた広温性酵素のモデル遺伝子の導入による大腸菌や広温菌細胞への毒性が確認されたため、代替としてスクリーニングの容易なタンパク質分解酵素等を使用して検証を進めている。さらに、並行して各種広温菌由来の酵素の活性測定を行った結果、一部で活性を確認している。広温性酵素の取得に向けて今後も引き続き検証を進める。

该研究主题的目的是开发一种新方法，以创建一种结合耐热性的广泛热酶，这在传统上是一种权衡的关系，在中等和低温下的活性很高。目的是使酶的高激活以及低温和耐热酶的高激活，而不会通过使用广泛的细菌将酶的定向进化而改变，而不会改变宿主，这些酶可以在广泛的温度中生长。在今年，我们尝试使用自主复制和基因组整合的质粒来改变包括kosmotoga和Geobacillus在内的广泛细菌的候选菌株。尽管尚未建立稳定的转化方法，但已经获得了具有耐药性的多种变换物，目前正在进行分析。此外，由于已经证实了对最初计划的泛浮子酶引入模型基因的毒性，因此已经证实了该模型基因，我们现在正在使用易于筛选的蛋白水解酶作为测试的替代方法。此外，由于源自各种广泛细菌的酶的活性，在某些情况下证实了活性。我们将来将继续进行验证，以获得宽温过温酶。