血液脳関門の破綻に着目した術後神経認知機能障害の発症機序解明

以血脑屏障破坏为重点阐明术后神经认知功能障碍的发病机制

基本信息

批准号：
21H03025
负责人：
祖父江和哉
金额：
$ 10.9万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H03025/
关键词：
術後神経認知機能障害血液脳関門ミクログリア

项目摘要

昨年度に確立した術後認知機能障害（NCD）モデルが、記憶のどの段階で障害を起こしているのか、新規物体認識試験（NOR）のtrainingとtestの間の時間を変えることで、短期記憶障害の確認をした。通常、NORではtrainingとtestの間は24時間空けるが、15分間に変えて、海馬を主体とした「記銘」の異常を確認できる。その結果、15分間にした場合は、認知機能の低下を認めず、短期記憶障害がないことが分かった。つまり、術後NCDモデルは、記銘の障害はなく、その後の記憶の保持・想起の段階に異常があることが判明した。血液脳関門（BBB）の破綻の部位と時間の検討を行うため、昨年度に引き続き、10kDaデキストランとトマトレクチンを同時に眼窩注することで血液と血管壁の染色をし、血管外への漏出がないか解析したが、デキストランの血管外への漏出を数値化することが困難だった。このため、色素を投与したマウスの脳組織の上清の蛍光輝度の測定に変更した。デキストランは眼窩注の確実性が低いため、フルオレセインの腹腔内投与に変更した。各種プロトコルを試行錯誤し、LPSモデルのBBBの破綻を、最終的にフルオレセインナトリウムの腹腔内投与で測定できるプロトコルを確立した。蛍光輝度の測定と並行して、2光子顕微鏡を用いて、術後NCDモデルのBBBの破綻の観察を行った。最初はフルオレセインの投与で観察を行っていたが、色素の追加投与の際に、残存色素があることから、投与後6時間で残存色素がなくなり、追加投与が可能なフルオレセインナトリウムに変更した。予備実験の22週齢の術後NCDモデルで、術後の血管外の色素の輝度値の上昇を認め、これがBBBの破綻であるか精査中である。また、この後に予定しているqAIM-MRI法や脳波の測定については、BBBの破綻部位と時間が判明次第、速やかに実施できるように準備を行った。

去年建立的术后认知功能障碍（NCD）模型通过改变新物体识别测试（NOR）的训练和测试之间的时间来确定记忆障碍发生在哪个阶段。通常，在NOR中，训练和测试之间有24小时的间隔，但通过将其改为15分钟，可以检查主要在海马体的“记忆”是否存在异常。结果显示，当持续时间为15分钟时，认知功能没有下降，也没有短期记忆障碍。也就是说，发现术后NCD模型的记忆力没有受损，但在随后的记忆保留和检索阶段却出现了异常。为了调查血脑屏障（BBB）破裂的位置和时间，我们从去年开始，同时向眼眶内注射10kDa右旋糖酐和番茄凝集素，对血液和血管壁进行染色，确保没有然而，很难量化血管外的右旋糖酐的泄漏。为此，我们改为测量给予染料的小鼠脑组织上清液的荧光强度。由于眶内注射右旋糖酐的可靠性较低，我们改为腹腔注射荧光素。通过各种方案的反复试验，我们最终建立了一个方案，允许我们通过腹膜内注射荧光素钠来测量 LPS 模型中的 BBB 破坏。在测量荧光亮度的同时，我们使用双光子显微镜观察术后 NCD 模型中的 BBB 破坏。最初，通过施用荧光素进行观察，但由于在施用追加染料时存在一些残留染料，因此施用后6小时残留染料消失，并且改变为荧光素钠，这允许追加施用。在初步实验中，22周大的术后NCD模型显示手术后血管外色素的亮度增加，我们目前正在研究这是否是由于血脑屏障破坏所致。此外，还为随后进行的qAIM-MRI方法和脑电图测量做好了准备，以便在确定BBB破坏的位置和时间后立即进行。