Mechanistic analysis of somatic cell reprogramming using paused iPSCs

使用暂停的 iPSC 进行体细胞重编程的机制分析

• 批准号: 21H02678
• 负责人: 久武 幸司
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02678/
• 关键词: iPS細胞; リプログラミング; 転写制御; クロマチン; Klf4; 転写因子; サイレンシング; E2F; 間葉上皮転換; XCR; RNA-seq; Xist

本研究では，様々な段階でリプログラミングを一時停止させた細胞群（Paused iPS細胞）を利用し，RNA-seqなどの遺伝子発現解析を基に，リプログラミングのメカニズムを解析する。これまでの研究から，リプログラミング初期に発現が減少する転写調節因子の中で，Osr2がリプログラミング効率に影響することを見出していた。今年度は，その分子メカニズムを明らかにするために，Osr2の機能的解析をさらに進めた。まず，NMuMG細胞でOsr2を過剰発現させると，この細胞の形態学的な特徴及び遺伝子発現の変化から，上皮間葉転換（EMT）が起こることが分かった。この際に,トランスフォーミング成長因子-β（TGF-β）シグナル伝達系を抑制するとEMTが消失することより，Osr2がTGF-βシグナル伝達系の誘導を介してEMTを引き起こすことが分かった。さらに，RNA-seqとGene Ontology解析から，NMuMG細胞でEMTが誘導される前には，細胞増殖が一時的に亢進することを見出した。リプログラミング中にOsr2を過剰発現させて，Osr2発現を維持させると，TGF-βのシグナル伝達が低下せずに，リプログラミングの効率も低下した。ここで，阻害剤によってTGF-βシグナル伝達系を抑制しても，リプログラミングの効率は完全には戻らなかった。この現象をRNA-seqで解析すると，Wntシグナル伝達系の活性化が見られないためであることを見出した。以上の結果から，1）Osr2がTGF-βシグナル伝達系の誘導を介してEMTを引き起こすこと，2）リプログラミング過程において，Osr2の発現減少はTGF-βシグナル伝達系を抑制するだけでなく，Wntシグナル伝達系を活性化することを明らかにした。

在本研究中，我们将使用重编程在各个阶段暂停的细胞群（Paused iPS细胞），并基于RNA-seq等基因表达分析来分析重编程的机制。前期研究发现，在重编程早期表达降低的转录调控因子中，Osr2会影响重编程效率。今年，我们进一步推进了Osr2的功能分析，以阐明其分子机制。首先，我们发现当Osr2在NMuMG细胞中过度表达时，基于这些细胞的形态特征和基因表达的变化而发生上皮间质转化（EMT）。此时，抑制转化生长因子-β (TGF-β) 信号系统会消除 EMT，表明 Osr2 通过诱导 TGF-β 信号系统引起 EMT。此外，通过RNA-seq和Gene Ontology分析，我们发现NMuMG细胞在诱导EMT之前，细胞增殖暂时增强。当Osr2在重编程过程中过度表达并维持Osr2表达时，重编程效率会降低，但TGF-β信号传导却不会减弱。在这里，即使用抑制剂抑制TGF-β信号系统，重编程的效率也无法完全恢复。当使用RNA-seq分析这种现象时，发现这是由于Wnt信号转导系统缺乏激活所致。上述结果表明，1）Osr2通过诱导TGF-β信号系统引起EMT，2）在重编程过程中，Osr2表达减少不仅抑制TGF-β信号系统，而且抑制TGF-β信号传导研究表明，这会激活 Wnt 信号转导系统。

项目成果

Downregulation of Odd-Skipped Related 2, a Novel Regulator of Epithelial-Mesenchymal Transition, Enables Efficient Somatic Cell Reprogramming

下调奇数跳跃相关 2（一种上皮-间质转化的新型调节因子）可实现高效的体细胞重编程

• 发表时间: 2021
• 作者: Nishimura K; Anh LPH; Linh NT; Kato T; Hisatake K
• 通讯作者: Hisatake K

Mechanistic analysis of pluripotency acquisition by using paused iPSCs

使用暂停的 iPSC 获得多能性的机制分析

• 发表时间: 2021
• 作者: Hamzah M; Nishimura K; Hisatake K
• 通讯作者: Hisatake K

Early reactivation of clustered genes on the inactive X chromosome during somatic cell reprogramming

体细胞重编程过程中失活 X 染色体上的簇基因的早期重新激活

• DOI: 10.1016/j.stemcr.2021.11.008
• 发表时间: 2022-01-11
• 期刊: Stem Cell Reports
• 影响因子: 5.9
• 作者: Aizawa S;Nishimura K;Mondejar GS;Kumar A;Bui PL;Tran YTH;Kuno A;Muratani M;Kobayashi S;Nabekura T;Shibuya A;Sugihara E;Sato TA;Fukuda A;Hayashi Y;Hisatake K
• 通讯作者: Hisatake K

Locus-Specific Isolation of the Nanog Chromatin Identifies Regulators Relevant to Pluripotency of Mouse Embryonic Stem Cells and Reprogramming of Somatic Cells

Nanog 染色质的位点特异性分离鉴定了与小鼠胚胎干细胞多能性和体细胞重编程相关的调节因子

• DOI: 10.3390/ijms232315242
• 发表时间: 2022-12-01
• 期刊: International Journal of Molecular Sciences
• 影响因子: 5.6
• 作者: A. K. Burramsetty;K. Nishimura;Takumi Kishimoto;Muhammad Hamzah;Akihiro Kuno;A. Fukuda;K. Hisatake
• 通讯作者: K. Hisatake

TINC - a method to dissect transcriptional complexes at single locus resolution - reveals novel Nanog regulators in mouse embryonic stem cells

• DOI: 10.1101/2020.04.03.023200
• 发表时间: 2020-04-04
• 期刊: bioRxiv
• 作者: A. Knaupp;M. Mohenska;M. Larcombe;E. Ford;Sm Lim;K. Wong;J. Chen;J. Firas;C. Huang;X. Liu;T. Nguyen;Yby Sun;M. Holmes;P. Tripathi;FJ Rossello;J. Schröder;C. Nefzger;PP Das;JJ Haigh;R. Lister;RB Schittenhelm;JM Polo
• 通讯作者: JM Polo