Elucidation of molecular mechanisms of neuronal differentiation and search for molecular markers of neurodegenerative diseases by glycoproteomics.

通过糖蛋白组学阐明神经元分化的分子机制并寻找神经退行性疾病的分子标志物。

基本信息

批准号：
21H02617
负责人：
川崎ナナ
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、神経変性疾患などの診断法や治療法の開発に資する研究として、神経変性疾患モデル細胞を用いて、神経分化に伴う糖タンパク質の糖鎖修飾とその機能を解析し、神経変性疾患に係わる糖鎖の構造や糖鎖生合成酵素を明らかにすることである。令和３年度は、iPS細胞 (iPSC) 由来アルツハイマー病 (AD)モデル神経前駆細胞を入手し、神経分化のための条件検討を行った。また、O型糖鎖修飾タンパク質の網羅的定量解析法の開発を目標として、データ非依存的(DIA)-MSの最適化を検討した。さらに、神経分化に関与するN型糖鎖修飾の特定を目標として、我々が既に見出している神経特異的N型糖鎖BA2の構造形成に不可欠なBeta-1,4-Mannosyl-Glycoprotein 4-Beta-N-Acetylglucosaminyltransferase（タンパク質名：GnT3;遺伝子名：MGAT3）のsiRNAによるノックダウン実験を行い、MGAT3の発現低下により、細胞増殖が亢進され神経分化が抑制されることを見出した。令和４年度は、第一にO型糖鎖の中でも特にADとの関係が指摘されているOGlcNAc糖鎖修飾を網羅的に解析することを検討した。データ非依存的(DIA)-MSに必要なOGlcNAc糖鎖結合ペプチドのライブラリを構築し、DIA-MSによる定量を行うことで、神経分化に伴うOGlcNAc修飾の変化を解析できることを確認した。第二に、前年度、神経分化におけるMGAT3の重要性が明らかになったことを踏まえ、神経細胞分化に係わる糖鎖生合成酵素を網羅的に解析する方法の開発を検討した。超網羅的タンパク質ライブラリを構築し、DIA-MSを行うことで、神経分化では硫酸化へパラン硫酸合成酵素が大きく変動することを見出した。

本研究的目的是利用神经退行性疾病模型细胞分析神经元分化过程中糖蛋白的糖基化及其功能，为神经退行性疾病诊断和治疗方法的发展做出贡献，目的是阐明糖链的结构。和参与退行性疾病的糖链生物合成酶。 2021财年，我们获得了源自iPS细胞（iPSC）的阿尔茨海默病（AD）模型神经祖细胞，并检查了神经分化的条件。此外，我们还研究了数据无关（DIA）-MS 的优化，目标是开发 O-糖基化蛋白质的综合定量分析方法。此外，为了识别神经元分化中涉及的 N-聚糖修饰，我们已经发现了 Beta-1,4-甘露糖基糖蛋白，它对于神经元特异性 N-聚糖 BA2 的结构形成至关重要。我们使用 siRNA 对 4-Beta-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（蛋白质名称：GnT3；基因名称：MGAT3）进行了敲低实验，发现 MGAT3 表达减少可增强细胞增殖并抑制神经分化。在2020财年，我们首先考虑全面分析OGlcNAc聚糖修饰，该修饰已被证明与O-聚糖中的AD特别相关。通过构建数据独立 (DIA)-MS 所需的 OGlcNAc 聚糖结合肽文库并通过 DIA-MS 对其进行定量，我们证实可以分析与神经分化相关的 OGlcNAc 修饰的变化。其次，基于去年MGAT3在神经元分化中的重要性被揭示的事实，我们考虑开发一种方法来全面分析参与神经元分化的糖链生物合成酶。通过构建超详尽的蛋白质库并进行DIA-MS，我们发现硫酸化硫酸乙酰肝素合酶在神经元分化过程中发生显着变化。