Structural basis of activation of a novel tumor progression signaling involving Wnt signaling proteins and supression by antibodies.

涉及 Wnt 信号蛋白和抗体抑制的新型肿瘤进展信号激活的结构基础。

基本信息

批准号：
21H02420
负责人：
柴田直樹
金额：
$ 8.32万
依托单位：
University of Hyogo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

R4年度は，研究計画調書に記した４項目のうち主に以下の３項目，① CKAP4-DKK複合体の構造解析，② CKAP4細胞外領域全体の構造解析，③ CKAP4-抗体フラグメント複合体の構造解析について研究を遂行した。以下にこれまでの結果について概要を示す。① CKAP4とDKK cysteine rich domain (DKK_CRD1)試料をそれぞれ別々に調製したものを混合し結晶化スクリーニングキットを用いて結晶化条件の検討を行ったところ，１条件において結晶が得られた。② CKAP4細胞外領域（128-602）のうち，431-602の領域について新たに発現系を構築し，結晶を得ることができた。放射光施設において回折実験を行ったところ，約 4オングストローム分解能のデータを得ることに成功した。③ ４種類の抗CKAP4モノクローナル抗体のFabフラグメントとCKAP4細胞外領域との複合体を調製した。結晶化スクリーニングを行うために十分な量の複合体試料を得ることが困難であったため，結晶構造解析法よりも少量での構造解析が可能なクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を目指して測定を行った。その結果，ほとんどの粒子がグリッド上で気液界面に集合していることが判明した。得られた画像データから単粒子解析を行ったが，明瞭な三次元再構成像を得ることが困難であった。二次元でのクラスタリングではCKAP4-Fab複合体と思われる像が得られたため，グリッド作成法の検討により明瞭な三次元再構成像を得ることは可能であると思われる。

在R4年，我们主要关注了研究计划文件中所写的四项中的以下三项：1）CKAP4-DKK复合物的结构分析，2）整个CKAP4胞外域的结构分析，以及3）对CKAP4-抗体片段复合物的结构进行了分析研究。以下是迄今为止的结果摘要。 ① 将分别制备的CKAP4和DKK富含半胱氨酸结构域（DKK_CRD1）样品混合，并使用结晶筛选试剂盒检查结晶条件，在一种条件下获得晶体。 ②针对CKAP4胞外区（128-602）的431-602区构建了新的表达系统，并获得了晶体。当在同步辐射装置上进行衍射实验时，我们成功获得了分辨率约为4埃的数据。 ③制备4种抗CKAP4单克隆抗体的Fab片段与CKAP4胞外区的复合物。由于很难获得足够量的复杂样品进行结晶筛选，因此我们的目标是使用冷冻电子显微镜进行单颗粒分析，这样可以用比晶体结构分析更少的量进行结构分析。结果表明，大部分颗粒聚集在气液界面的网格上。根据获得的图像数据进行单粒子分析，但很难获得清晰的三维重建图像。二维聚类产生的图像似乎是 CKAP4-Fab 复合体，因此似乎可以通过检查网格创建方法来获得清晰的三维重建图像。