脊髄損傷への移植細胞の選択・化学的刺激による神経成熟・髄鞘化の促進と運動機能改善

通过选择和化学刺激移植细胞治疗脊髓损伤，促进神经元成熟和髓鞘形成并改善运动功能

• 批准号: 19K18541
• 负责人: 河合 桃太郎
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K18541/
• 关键词: 脊髄損傷; 再生医療; 神経前駆細胞移植; iPS細胞; DREADD; シナプス伝達; ヒトiPS細胞; 細胞移植; 神経前駆細胞; chemogenetics; hM3Dq; chemogenetic; 脊髄損傷; 再生医療; 神経前駆細胞移植; iPS細胞; DREADD; シナプス伝達; ヒトiPS細胞; 細胞移植; 神経前駆細胞; chemogenetics; hM3Dq; chemogenetic

hM3Dq を発現するレンチウイルスを作成した。作成したレンチウイルスを用いて、iPS 細胞由来の神経前駆細胞にhM3Dq を発現させた。発現させたhM3Dq がClozapine N-oxide（CNO）に反応して細胞内Ca 濃度を変化させることをCa イメージングの手法で確認した。Ca 上昇後に神経細胞の活動性の上昇がおこることをImmediate early genes の発現量の定量によって確認をした。更にhM3Dq発現細胞はCa 上昇に引き続いて周囲のhM3Dq非発現細胞を活性化させることを同様に確認した。同様の神経前駆細胞を脊髄損傷後のマウスに移植をして、連日CNO を腹腔内投与することで移植細胞を選択的に刺激した。42日間の観察で、移植に加えてCNO を腹腔内投与した群(CNO投与群)で運動機能が回復することを様々な運動機能評価によって確認をした。CNO による細胞刺激によって、移植組織中で変化が起こっている変化を移植後脊髄のRNA sequenceによって検討した。損傷後14日のマウスにおいて、CNO投与群では非投与群と比較しシナプスに関連する遺伝子群で発現上昇が起こっていることを確認した。Gene Ontology 解析やGene Set Enrichment Analysis においても同様にシナプス関連の遺伝子の発現上昇が起こっていることを確かめた。更にSyn1やvGLUT1やvGATといったシナプスに関連するタンパク質についても同様にCNO投与群で発現上昇が起こっていることをcapillary electrophoresisで定量し確認した。これらの検討から、CNO 投与による選択的な移植細胞の刺激によって、移植細胞と移植部周囲のマウスの細胞の間でシナプス伝達を亢進させることが運動機能の改善に寄与することが考えられた。

创建了表达HM3DQ的慢病毒。使用生成的慢病毒，HM3DQ在衍生自IPS细胞的神经祖细胞中表达。 CA成像技术证实，表达的HM3DQ会因响应氯氮平N氧化物（CNO）而改变细胞内Ca浓度。我们证实，通过定量直接早期基因的表达水平升高，神经元活性的增加发生在CA升高后。此外，同样证实，表达HM3DQ的细胞在Ca上升后激活周围表达HM3DQ的细胞。脊髓损伤后，将相似的神经祖细胞植入小鼠中，并每天通过腹膜内施用CNO选择性刺激植入的细胞。在42天的观察期间，各种运动功能评估证实，在腹膜内施用CNO的组中，运动函数恢复（经CNO处理的组）。通过移植后脊髓RNA序列检查通过细胞刺激在移植组织中发生的变化。在损伤后14天后，在CNO组中与未处理的组相比，在CNO组中，与突触相关基因组的表达升高。同样，我们证实了与突触相关的基因表达在基因本体论和基因集富集分析中升高。此外，毛细管电泳类似地证实了与突触相关的蛋白（如Syn1，vglut1和VGAT），以确认CNO给药组中的表达升高。这些研究表明，通过给予CNO来选择性刺激移植细胞以增强移植细胞和周围小鼠细胞之间的突触传播，从而有助于改善运动功能。