心筋ミオシンII構造変化に基づく肥大型心筋症の病態発症機序の解明

基于心肌肌球蛋白II结构变化阐明肥厚型心肌病病理机制

• 批准号: 20K22922
• 负责人: 神窪 謙太
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-09-11 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K22922/
• 关键词: 肥大型心筋症; サルコメア; ミオシン; ミオシン調節軽鎖

遺伝性肥大型心筋症(HCM)では、過剰収縮性を獲得する変異(hyper-contractile変異)のみでなく、収縮性が低下する変異(hypo-contractile変異)の相反する表現系が存在する。特にミオシン重鎖(MHC-β)の変異ではhyper-contractile変異が多く、ミオシン調節軽鎖(MLC2)の変異ではhypo-contractile変異の報告が多い。本研究では、これらの変異に基づくミオシン分子の構造(SRX/DRX)や収縮性、エネルギー消費の変化を同時に観察するため、種々の実験系構築に着手した。まず、本研究を遂行する上で必須となる、HCM変異をノックインしたiPS細胞由来心筋細胞株の作製を試みた。CRISPR-Cas9システムを用いることで、MHC-β変異(R403Q, F764L)及びMLC2変異(R403Q, R58Q)を導入した細胞株を樹立した。次に、ミオシン分子におけるSRX/DRXの存在比率を捉えるため、蛍光標識ヌクレオチドであるMant-ATPを心筋細胞に導入し、タイムラプスイメージングによってリアルタイムでの評価を可能とした。最後に、心筋細胞の収縮性を定量的に評価するため、高速撮影機能を備えたセルモーションイメージングシステムSI8000を用いて、発生張力と相関する細胞変形距離を測定するシステムと、直接的に培養心筋細胞の発生張力を測定できるcell force assayの2つの収縮測定系を確立した。今後は、変異導入したiPS細胞由来心筋細胞を用いることで、同時に確立してきた収縮・代謝系により機能評価を進める予定である。

在遗传性肥厚型心肌病（HCM）中，存在矛盾的表型，不仅有获得过度收缩性的突变（收缩性过度突变），而且还存在降低收缩性的突变（收缩性减弱突变）。特别是，有许多关于肌球蛋白重链（MHC-β）的过度收缩突变和肌球蛋白调节轻链（MLC2）的低收缩突变的报道。在本研究中，我们开始构建各种实验系统，以同时观察基于这些突变的肌球蛋白分子的结构（SRX/DRX）、收缩性和能量消耗的变化。首先，我们尝试创建具有敲入 HCM 突变的 iPS 细胞衍生的心肌细胞系，这对于开展这项研究至关重要。通过使用CRISPR-Cas9系统，建立了引入MHC-β突变（R403Q、F764L）和MLC2突变（R403Q、R58Q）的细胞系。接下来，为了确定肌球蛋白分子中SRX/DRX的丰度比，将荧光标记的核苷酸Mant-ATP引入心肌细胞中，并通过延时成像实现实时评估。最后，为了定量评估心肌细胞的收缩力，我们使用配备高速成像功能的细胞运动成像系统SI8000来测量与产生的张力相关的细胞变形距离，并直接测量培养的心肌我们建立了两个用于细胞力测定的收缩测量系统，可以测量细胞中产生的张力。未来，我们计划使用突变的iPS细胞来源的心肌细胞来评估我们同时建立的收缩和代谢系统的功能。