肺線維化病態における血漿中ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡの探索研究

肺纤维化病理中血浆细胞游离DNA的探索性研究

• 批准号: 20K17199
• 负责人: 猪俣 稔
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K17199/
• 关键词: 特発性肺線維症; cell free DNA; C57BL/6マウス; ブレオマイシン

Human foetal lung fibroblast(HFL-1)においてSYBR Gold(Thermo Fisher Scientific)を用いてcfDNAの定量解析を行った。HFL-1の培養液中cfDNAは606.7 ng/mLであり、TGF-β 10 ng/mL投与後の培養液中cDNAは1179.4 ng/mLまで上昇し、TGF-β刺激によりcfDNAが上昇することが確認された。C57BL/6マウスにブレオマイシン（BLM）をosmotic pumpで100mg/kg投与しBLM誘発肺線維症モデルマウスを作製した。BLM投与後1週間のマウスに加え、BLM非投与マウス(normal control：NC)をそれぞれサクリファイスし、採取した血液を2000×g、10分間で遠心分離し血清を採取した。NucleoSpin cfDNA XSを用いて血清からcell free DNA(cdDNA)を抽出した。その後Quanti-iTTM ds DNA Assay kit、PicoGreenを用いてcfDNAを定量した。cfDNA中央値はNC群で16112.5 ng/μL、BLM群で16064.6 ng/μLであった。A549とHFL-1をraptinalを用いて培養し上清をNucleoSpin cfDNA XSを用いてcdDNAを抽出し、cfDNAサイズの分布を解析するためバイオアナライザーで解析したところ160bp付近でピークが見られた。またBLM誘発肺線維症モデルマウス血清由来のcfDNAを用いてバイオアナライザーを用いて解析を行ったところ、BLM群で160bp 付近にピークが見られた。

使用 SYBR Gold (Thermo Fisher Scientific) 对人胎肺成纤维细胞 (HFL-1) 进行 cfDNA 定量分析。 HFL-1培养液中的cfDNA为606.7 ng/mL，给予10 ng/mL TGF-β后，培养液中的cDNA增加至1179.4 ng/mL，表明cfDNA因TGF-β而增加刺激确认。使用渗透泵将博来霉素 (BLM) 以 100 mg/kg 剂量给予 C57BL/6 小鼠，以创建 BLM 诱导的肺纤维化模型小鼠。除了BLM施用后1周的小鼠之外，还处死未施用BLM的小鼠(正常对照：NC)，将收集的血液以2000×g离心10分钟以收集血清。使用 NucleoSpin cfDNA XS 从血清中提取无细胞 DNA (cdDNA)。然后，使用 Quanti-iTTM ds DNA 检测试剂盒和 PicoGreen 对 cfDNA 进行定量。 NC 组的中位 cfDNA 为 16112.5 ng/μL，BLM 组的中位 cfDNA 为 16064.6 ng/μL。使用raptinal培养A549和HFL-1，使用NucleoSpin cfDNA从上清液中提取cdDNA此外，当使用生物分析仪分析源自BLM诱导的肺纤维化模型小鼠的血清的cfDNA时，在BLM组中在160bp附近观察到峰。