高等真核生物RNAポリメラーゼIIによる伸長転写制御の解明

高等真核RNA聚合酶II对延伸转录控制的阐明

基本信息

批准号：
20K15736
负责人：
上島珠美
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物における転写機構の解明に酵母RNA ポリメラーゼIIがその扱いやすさから研究対象として用いられるが、同じ真核生物であっても酵母と哺乳類の転写機構や関連制御因子の違いは多い。本研究は哺乳類RNAポリメラーゼIIを研究対象とし、豚胸腺から内在性因子の調整を試み、12サブユニットで構成されるRNA ポリメラーゼIIの調整に成功した。他の転写制御関連因子(ヒトDSIF, NELF, P-TEFb/TAT, AFF4)はレコンビナント発現系（大腸菌、バキュロウイルスによる昆虫細胞、celll free発現系）を利用し、様々なカラムや沈殿法を駆使し、サンプル調製を行った。精製過程や構造解析で使用するDNA-RNA　hybridの適切な設計も行い、Grafix法のようなタンパク質分子量分離手法を行いながらクロスリンクを行う方法や、抗体によるアフィニティー精製を駆使し、クライオ電子顕微鏡試料として最適な高純度サンプルを確立することに成功した。データーの測定、解析を行った結果、6.7Aで負の制御因子NELFと共同で働くDSIFが結合したRNAポリメラーゼIIの構造解析に成功し、その構造情報から負の制御因子NELFが、RNAポリメラーゼII上のヌクレオチドエントリーサイトを塞ぐような形でサブユニットA/Cを結合させている構造が観察された。また、RNAポリメラーゼIIの動きを妨げるように、はさみこむような形でNELF複合体が結合しており、構造情報からNELFが結合することでRNAポリメラーゼIIの動きを抑制していることが示唆された。さらには、哺乳類RNAポリメラーゼIIの試験管内転写再構成系も確立し、NELF存在下ではHIVのmRNAの合成がある一定の場所で止まる(Pause)ことも明らかにした。本研究の実績は、今後、HIVによる感染宿主RNAポリメラーゼIIの征服機構に活かしていく。

酵母RNA聚合酶II因其易于操作而被用作阐明真核生物转录机制的研究靶点，但尽管酵母和哺乳动物同为真核生物，但酵母和哺乳动物之间的转录机制和相关调控因子存在许多差异。哺乳动物。本研究以哺乳动物RNA聚合酶II为研究对象，尝试调控猪胸腺内源性因子，并成功调控由12个亚基组成的RNA聚合酶II。其他转录控制相关因子（人 DSIF、NELF、P-TEFb/TAT、AFF4）使用重组表达系统（大肠杆菌、使用杆状病毒的昆虫细胞、无细胞表达系统）以及各种柱和沉淀方法和样品进行表达。准备。我们还适当设计了纯化过程和结构分析中使用的DNA-RNA杂交体，并在进行Grafix法等蛋白质分子量分离方法以及使用抗体的亲和纯化时利用交联方法，我们成功地建立了最佳方法。高纯度样品。通过测量和分析数据，我们成功分析了与 DSIF 结合的 RNA 聚合酶 II 的结构，该酶与 6.7A 的负调节因子 NELF 一起作用，观察到亚基 A/C 结合的结构。阻断上部核苷酸进入位点的方式。此外，NELF复合物以夹心方式结合以阻止RNA聚合酶II的运动，结构信息表明NELF结合并抑制RNA聚合酶II的运动。此外，我们建立了哺乳动物RNA聚合酶II的体外转录重建系统，发现在NELF存在的情况下，HIV mRNA合成在某个点暂停。该研究成果将应用于HIV感染宿主RNA聚合酶II的抑制机制。