Verification of the subfunctionalization hypothesis in paralogous genes by engrafting cis-regulatory elements

通过植入顺式调控元件验证旁系同源基因的亚功能化假说

基本信息

批准号：
21H02543
负责人：
隅山健太
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Nagoya University (2022-2023)Institute of Physical and Chemical Research (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

2022年度はDlx3-4遺伝子クラスターおよびDlx5-6遺伝子クラスターの構造の類似性に注目し、CTCFによる長距離ゲノム領域間でのループ形成などによって物理的にプロモーターと近くなる領域のクラスター間での構造的類似性および鰓弓でのエンハンサー活性の強さから、Dlx3-4遺伝子クラスターではTAD3鰓弓エンハンサー、Dlx5-6遺伝子クラスターでは新規の鰓弓のエンハンサーをそれぞれターゲットとして選定し、エンハンサーノックアウトマウスをCRISPR/Cas9で作製し系統化した。このマウスを用いて、正確にエンハンサー欠失の発現量変化を定量できるAccu-cis法を用いてRNA-seq結果から鰓弓発現に及ぼすその影響を評価した。Dlx56鰓弓エンハンサー欠失マウスでは下顎が上顎化する顕著な表現型が観察された。このマウスの表現型をパラログ活性化でレスキューすることが可能かどうかを確認するため、Dlx56鰓弓エンハンサーをDlx3-4遺伝子クラスターにノックインしたマウスを作成し、交配によりその解析を進めているところである。また、Dlx3-4遺伝子の鋤鼻器エンハンサーをクラスターとして欠失することで効率よく鋤鼻器組織特異的なノックダウンを実現できることが示され、新たな条件付きノックアウトマウス作成の方法論へとつながる成果となった。特に、通常ノックアウトで致死的な表現型を示す遺伝子の場合に、この方法により致死性を回避しつつ特定器官での遺伝子機能解析が可能になる新たな実験系として期待し検証を進めている。

2022年，我们将重点关注Dlx3-4基因簇和Dlx5-6基因簇的结构相似性，并通过CTCF研究由于长距离基因组区域之间形成环而物理上靠近启动子的区域簇之间的结构鳃弓的相似性和恩哈。基于其强大的抑制活性，我们选择了 Dlx3-4 基因簇的 TAD3 鳃弓增强子和 Dlx5-6 基因簇的新型鳃弓增强子作为靶标，并使用 CRISPR/Cas9 创建了增强子敲除小鼠并进行了品系。使用这些小鼠，我们使用 Accu-cis 方法根据 RNA-seq 结果评估了增强子删除对鳃弓表达的影响，该方法可以准确量化增强子删除导致的表达水平的变化。在缺乏 Dlx56 鳃弓增强剂的小鼠中，观察到下颌变成上颌的显着表型。为了确认这种小鼠表型是否可以通过旁系同源激活来挽救，我们创建了将 Dlx56 鳃弓增强子敲入 Dlx3-4 基因簇的小鼠，目前正在通过杂交对其进行分析。此外，研究表明，删除 Dlx3-4 基因的犁鼻增强子簇可以实现有效的犁鼻器官组织特异性敲除，这一成就将导致创建条件敲除小鼠的新方法。特别是，对于通常在被敲除时表现出致死表型的基因，我们希望这种方法将成为一种新的实验系统，使我们能够分析特定器官中的基因功能，同时避免致死。