Dynamic Structural Analysis of Protein Translocation Across Membrane by Cryo-EM

利用冷冻电镜对蛋白质跨膜易位进行动态结构分析

基本信息

批准号：
21H02452
负责人：
津下英明
金额：
$ 8.32万
依托单位：
Kyoto Sangyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ウェルシュ菌が持つbinary毒素である、膜孔形成毒素Ibの構造と機能解析を進めている。膜孔形成毒素Ibはアクチン特異的ADPリボシル化する酵素Iaを膜透過させるトランスロコンである。IaがアクチンのADPリボシル化毒性を発揮するためにはIbが①水溶性プレ膜孔オリゴマー(7量体）を形成、次に細胞膜上で構造変化をおこし②Ibオリゴマーからなる膜孔を形成、③これにIaが結合し、Iaの立体構造がほどけて、④IaがIbオリゴマー膜孔を通過する、この４つのステップが必要となる。我々はクライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析により、Ib膜孔とIaが結合したIb膜孔の構造をそれぞれ2.9オングストローム;の分解能で決定することに成功している(2020年）。これに続いて、抗生物質耐性菌の感染が問題となっているディフィシル菌が持つ二成分毒素CDTの構造をクライオ電子顕微鏡を用いて明らかにした（Nature Communications, 2022)。界面活性剤LMNGの存在下で、CDTa結合したCDTb膜孔を調製、電子顕微鏡でのデータ測定と解析を進めた。その結果、ダイヘプタマーの14量体とともにイオタ毒素と同様の７量体のCDTb膜孔構造が存在していることがわかった。これにCDTaを加えて、クライオ電子顕微鏡での構造決定を行った。其の結果CDTa１分子がCDTb膜孔に結合した構造を明らかにした。さらに、CDTaがCDTb膜孔に結合した状態での構造解析から、結合したばかりのCDTaとCDTb膜孔複合体と、CDTaのN末端のαヘリックスが一部解けた状態とCDTb膜孔複合体の２つの構造をそれぞれ精密化して明らかにした。これはN末端のαヘリックスのアンフォールディングの動的な様子を捉えた初めての報告となった。

我们目前正在分析产气荚膜梭菌拥有的一种二元毒素——成孔毒素 Ib 的结构和功能。成孔毒素 Ib 是一种易位子，可透化肌动蛋白特异性 ADP-核糖基化酶 Ia。为了使Ia对肌动蛋白发挥ADP-核糖基化毒性，Ib①形成水溶性的膜前孔寡聚体（七聚体），然后引起细胞膜上的结构变化，②形成由Ib寡聚体构成的膜孔，并且③这四个步骤是必要的：Ia与其结合，Ia的三维结构被解开，（4）Ia穿过Ib低聚物膜孔。我们利用冷冻电子显微镜进行单粒子分析，成功确定了 Ib 膜孔和与 Ia 结合的 Ib 膜孔的结构，每个孔的分辨率均为 2.9 埃（2020）。随后，他们使用冷冻电子显微镜揭示了 CDT 的结构，CDT 是艰难梭菌所具有的一种双成分毒素，由于抗生素耐药性细菌感染而成为一个问题（Nature Communications，2022）。在表面活性剂LMNG的存在下，我们制备了CDTa结合的CDTb膜孔，并使用电子显微镜进行数据测量和分析。结果发现，与iota毒素类似的七聚体CDTb膜孔结构与14聚体二七聚体一起存在。向其中添加CDTa并使用冷冻电子显微镜确定结构。结果，我们揭示了 CDTa1 分子与 CDTb 膜孔结合的结构。此外，对与CDTb膜孔结合的CDTa的结构分析表明，新结合的CDTa和CDTb膜孔复合物、CDTa N末端部分解开的α螺旋以及CDTb膜孔复合物的两种结构被细化。并澄清。这是第一份捕获 N 端 α 螺旋动态展开的报告。