Elucidation of the mechanism of amyloid fibrillation of alpha-synuclein starting from liquid-liquid phase separation

从液-液相分离出发阐明α-突触核蛋白淀粉样蛋白纤维化的机制

基本信息

批准号：
21H02442
负责人：
菅瀬謙治
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

αシヌクレインのアミロイド線維化は、神経変性疾患の１つであるパーキンソン病の発症と強い相関がある。このタンパク質は神経細胞内でユビキチン化されるが、最近の研究から、ユビキチン化αシヌクレインが液-液相分離し、それが軸索輸送と呼ばれる神経細胞の流れによってアミロイド線維化することが示唆された。しかし、この一連の過程の詳細、とくに構造変化や凝集状態の変化などはよく分かっていない。そこで本研究では、神経細胞内で実際に起こっているαシヌクレインのユビキチン化と軸索輸送（流れ）を試験管内に再現し、それを原子・分子レベルで解析することによって、αシヌクレインの液-液相分離とアミロイド線維化の機構を解明する。加えて、細胞実験により、どのような凝集状態が細胞毒性を示すのかを明らかにする。なお、流れの存在下における原子レベルの解析には、申請者らが独自に開発したRheo-NMRを用いる。本年度はαシヌクレインの発現・精製のプロトコルを見直して、収量を上げることを試みた。タグなしのαシヌクレインを大腸菌発現系で発現し、細胞破砕液の上清を酸性にすることによって不要な夾雑物を沈殿させる戦略をとった。実際にはこの後にイオン交換クロマトグラフィーも行ったが、大幅に精製αシヌクレインの収量を上げることに成功した。得られたαシヌクレインに種々の濃度でPEGを添加し、液-液相分離する条件を検討した。先行研究ではリン酸バッファーやトリスバッファーで液-液相分離する条件が調べられていたが、申請者らは過去にαシヌクレインのRheo-NMR測定でMOPSを用いたため、この実験ではMOPSで液-液相分離することを確認した。また、液-液相分離する条件で各種３次元NMR測定を行った。

α-突触核蛋白的淀粉样纤维颤动与帕金森病（一种神经退行性疾病）的发病密切相关。这种蛋白质在神经细胞内被泛素化，最近的研究表明，泛素化的 α-突触核蛋白经历液-液相分离，然后由于称为轴突运输的神经细胞流动而变成淀粉样原纤维。然而，这一系列过程的细节，特别是结构变化和聚集状态的变化，人们还不太清楚。因此，在本研究中，我们在体外重现了神经元内实际发生的α-突触核蛋白的泛素化和轴突运输（流动），并在原子和分子水平上对其进行了分析，阐明了液相分离和淀粉样纤维颤动的机制。此外，通过细胞实验，我们将阐明什么样的聚集状态表现出细胞毒性。对于存在流动的原子级分析，将使用申请人最初开发的Rheo-NMR。今年，我们回顾了 α-突触核蛋白表达和纯化方案，试图提高产量。我们采用了一种策略，在大肠杆菌表达系统中表达未标记的 α-突触核蛋白，并通过酸化细胞裂解物的上清液来沉淀不必要的污染物。事实上，此后还进行了离子交换色谱，我们成功地显着提高了纯化α-突触核蛋白的产量。我们将不同浓度的 PEG 添加到获得的 α-突触核蛋白中，并研究了液-液相分离的条件。先前的研究调查了使用磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液进行液-液相分离的条件，但由于申请人之前使用MOPS进行α-突触核蛋白的Rheo-NMR测量，因此在本实验中，使用MOPS来分离液-液相。确认发生了液相分离。此外，在液-液相分离条件下进行了各种三维NMR测量。