病原菌ヘムトランスポーターの構造変化の追跡と基質輸送機構の解明

追踪病原体血红素转运蛋白的结构变化并阐明底物转运机制

• 批准号: 21H02421
• 负责人: 杉本 宏
• 金额: $ 10.98万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02421/
• 关键词: ヘム; 構造解析; X線結晶構造解析; クライオ電子顕微鏡; トランスポーター; 膜輸送

病原菌は宿主に感染した際に、血液ヘモグロビンから鉄をヘムの形で奪い取り、増殖に必要な栄養素として利用している。そのため、ヘムの取り込みは感染症を抑制する上でも注目されてきた。本課題では、グラム陰性の病原性細菌でアデノシン三リン酸（ATP）依存的にペリプラズム空間から細胞質へとヘムの膜輸送を行うABC型ヘムトランスポーターの構造変化のメカニズムを明らかにすることを目指している。これまでの当グループによる研究で明らかにした結晶構造からは、分子の中心を通る基質輸送チャネルに大きな構造変化が起こることが示唆されたが、ヘムやATPが結合した状態での構造は未だに決定できていないせいもあり、メカニズムの理解が全く進んでいない。本年度は、前年度に引き続きクライオ電子顕微鏡によって、ヘムの輸送過程の各構造のスナップショットを取得することを目指した。界面活性剤や両親媒性ポリマーなどの可溶化剤の種類を含めて精製方法の検討を進めた結果、観察グリッド上でのタンパク質粒子の分散性が向上する条件を見出した。休止状態のアポ型とATPアナログ結合型について、クライオ電子顕微鏡による画像データの収集と3次元画像解析による構造決定を行なった。さらに、ABCトランスポーターのなかでバクテリアのヘムトランスポーターと同じサブファミリー（タイプIIインポーター）に分類されるFe/Mnイオントランスポーターについても大腸菌を利用した組み換え体の発現系構築を行なった。各サブユニットの遺伝子の配置やタグの種類・位置などのプラスミドデザインや培養の際の様々な条件を変えて発現スクリーニングを行ったうえで小スケールでの精製を実施した。

当致病菌感染宿主时，它们会以血红素的形式从血液中的血红蛋白中窃取铁，并将其用作增殖所需的营养物质。因此，血红素摄取作为抑制传染病的手段而受到关注。在本项目中，我们的目的是阐明革兰氏阴性病原菌中 ABC 型血红素转运蛋白的结构变化机制，该转运蛋白以三磷酸腺苷 (ATP) 依赖性方式将血红素从周质空间转运到细胞质。本课题组迄今为止的研究揭示的晶体结构表明，在通过分子中心的底物传输通道中发生了主要的结构变化，但血红素和ATP结合状态下的结构尚未确定。部分原因是还没有完成，对机制的理解根本没有进展。今年，与去年一样，我们的目标是使用冷冻电子显微镜获得血红素运输过程中每个结构的快照。通过检查纯化方法，包括表面活性剂和两亲聚合物等增溶剂的类型，我们发现了可以改善观察网格上蛋白质颗粒分散性的条件。我们使用冷冻电子显微镜收集图像数据，并使用冷冻电子显微镜和三维图像分析确定静息 apo 形式和 ATP 类似物结合形式的结构。此外，我们利用大肠杆菌构建了Fe/Mn离子转运蛋白的重组表达系统，该转运蛋白与ABC转运蛋白中的细菌血红素转运蛋白属于同一亚科（II型输入蛋白）。通过改变各种质粒设计和培养条件（例如每个亚基的基因排列以及标签的类型和位置）进行表达筛选后，进行小规模纯化。

项目成果

時間分解分光測定を用いたABCトランスポーターBhuUV-Tにおけるヘム輸送機構の解析

使用时间分辨光谱分析 ABC 转运蛋白 BhuUV-T 中的血红素转运机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 原明穂;城宜嗣;杉本宏;木村哲就
• 通讯作者: 木村哲就

Structural analyses of ABC transporters in nucleotide bound states investigated by CW-ESR spectroscopy

通过 CW-ESR 光谱研究核苷酸结合态 ABC 转运蛋白的结构分析

• 发表时间: 2021
• 作者: 仲絢香;小堀康博;鍔木基成;城宜嗣;杉本宏;木村哲就
• 通讯作者: 木村哲就

High-resolution structural analysis of the heme proteins using neutron and XFEL crystallography

使用中子和 XFEL 晶体学对血红素蛋白进行高分辨率结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 磯貝樹;廣澤幸一朗;菅野未希;横田康成;鈴木健一;Hiroshi Sugimoto
• 通讯作者: Hiroshi Sugimoto

A Heme‐Acquisition Protein Reconstructed with a Cobalt 5‐Oxaporphyrinium Cation and Its Growth‐Inhibition Activity Toward Multidrug‐Resistant Pseudomonas aeruginosa

用 5-氧代卟啉钴阳离子重建的血红素获取蛋白及其对多重耐药铜绿假单胞菌的生长抑制活性

• DOI: 10.1002/anie.202112456
• 发表时间: 2022
• 期刊: Angewandte Chemie International Edition
• 作者: Takiguchi Asahi;Sakakibara Erika;Sugimoto Hiroshi;Shoji Osami;Shinokubo Hiroshi
• 通讯作者: Shinokubo Hiroshi

中性子・XFEL・シンクロトロン結晶学を駆使したヘムタンパク質の精密構造解析

使用中子、XFEL 和同步加速器晶体学对血红素蛋白进行精确结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: Tanaka Saki;Morita Mikio;Yamagishi Tatsuya;Madapally Hridya Valia;Hayashida Kenichi;Khandelia Himanshu;Gerle Christoph;Shigematsu Hideki;Oshima Atsunori;Abe Kazuhiro;杉本 宏
• 通讯作者: 杉本 宏