翻訳停滞解消因子YaeJの生理的役割と反応機構の解明

阐明翻译失速解决因子YaeJ的生理作用和反应机制

基本信息

批准号：
21H02113
负责人：
栗田大輔
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Hirosaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02113/
关键词：
リボソーム YaeJ 翻訳タンパク合成

项目摘要

本研究は、YaeJによるリボソームレスキュー機構の分子メカニズムを明らかにするために、YaeJ/リボソーム複合体に対して、機能解析および構造解析を行うものである。令和4年度は部位特異的ラジカルプロービングを中心に進めた。システインを導入したYaeJ変異体を多数作製し、in vitroでペプチジルtRNA加水分解の活性を確認した。多くの変異体について野生型YaeJと同等の活性を有していることを確認した。次にin vitroで翻訳停滞リボソームに対するプロービングを行った。その結果YaeJのリボソーム上での結合位置を特定することに成功した。また、ペプチジルtRNAの活性が低下した変異体について、バイオレイヤー干渉法によってリボソームへの結合活性を評価した。その結果、YaeJのC末端の塩基性アミノ酸に変異を導入すると、野生型YaeJと比べて解離定数Kdが30倍以上上昇しており、リボソームへの結合活性の低下が見られた。前年度にリボソーム関連遺伝子の欠損株に由来するリボソームについて、YaeJのリボソームへの結合には影響しないがペプチジルtRNA加水分解活性を低下させることを発見した。このリボソームに対してYaeJのラジカルプロービングを行ったところ、ラジカルプロービングのパターンに変化が見られた。

在本研究中，我们对YaeJ/核糖体复合物进行了功能和结构分析，以阐明YaeJ拯救核糖体的分子机制。 2020 财年，我们专注于特定位点的激进探测。我们生成了大量引入半胱氨酸的YaeJ突变体，并在体外证实了它们的肽基-tRNA水解活性。已证实许多突变体具有与野生型YaeJ相当的活性。接下来，我们在体外探测了翻译停滞的核糖体。结果，我们成功确定了YaeJ在核糖体上的结合位置。此外，我们通过生物层干涉测量法评估了肽基-tRNA 活性降低的突变体的核糖体结合活性。结果，当YaeJ的C端碱性氨基酸引入突变时，与野生型YaeJ相比，解离常数Kd增加了30倍以上，表明核糖体结合活性降低。去年，我们发现缺乏核糖体相关基因的菌株来源的核糖体不会影响YaeJ与核糖体的结合，但会降低肽基-tRNA的水解活性。当使用 YaeJ 对该核糖体进行自由基探测时，观察到自由基探测模式发生变化。