遷移金属化学のケミカルバイオロジーへの展開

过渡金属化学向化学生物学的发展

• 批准号: 20K20591
• 负责人: 袖岡 幹子
• 金额: $ 16.64万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-07-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K20591/
• 关键词: アフィニティー精製; タグ; 修飾ペプチド; 遷移金属; パラジウム

アフィニティーラベリングによる生物活性分子の標的タンパク質や結合部位の決定は、生物活性分子にタグを導入し、修飾されたタンパク質やそれを酵素消化して得られるペプチドを検出・同定することによって行われる。しかし多量の非修飾ペプチドの共存下で目的とする修飾ペプチドを同定することは容易ではない場合も多く、同定の効率化のためには、タグを導入した生物活性分子でラベルされたペプチドを効率的に精製することが必要となる。一般的にはアルキンタグを標的化合物に導入し、クリック反応でアルキンにビオチンを導入したのちに精製を行うが、クリック反応後の精製操作でサンプルをロスしたり、導入したビオチンがペプチドを不溶化させたり、イオン化効率を悪くさせたりすることなどが問題としてあげられる。そこで本研究では遷移金属化学を利用することで、クリック反応などを用いずに直接タグ分子を精製する技術を開発する。本年度は昨年度検討したタグと遷移金属錯体の組み合わせに関して、引き続き検討を進めた。昨年度の検討を生かし、タグを導入した化合物により標的とする蛋白質を細胞内で標識し、抽出した蛋白質混合物から酵素消化でペプチド断片混合物を調製した。これを固相担体に固定化した金属錯体を用いて捕捉・濃縮することを試みた結果、目的とするペプチド断片を濃縮し、検出することに成功した。一方で本年度は、並行して昨年度とは異なるタグおよび金属錯体の組み合わせも検討し、こちらでもタグで標識されたペプチドの捕捉に成功した。新たなタグに関しては共有結合型の酵素阻害剤に導入し、酵素と共有結合を形成した後に、修飾部位を含むペプチド断片を捕捉・濃縮できることも確認した。

通过亲和标记确定目标蛋白和生物活性分子的结合位点是通过将标签引入生物活性分子并检测和鉴定修饰蛋白和酶消化修饰蛋白获得的肽来进行的。然而，在大量未修饰肽共存的情况下，常常很难鉴定出所需的修饰肽，并且为了提高鉴定效率，需要有效地使用带有标签的生物活性分子标记的肽。介绍了有必要纯化该材料。一般是在目标化合物中引入炔烃标签，通过点击反应将生物素引入到炔烃中，然后进行纯化，但在点击反应后的纯化过程中样品可能会丢失，或者引入的生物素可能会使肽不溶解的问题包括电离效率的恶化。因此，在这项研究中，我们将开发一种利用过渡金属化学直接纯化标签分子而不使用点击反应的技术。今年，我们继续研究去年研究的标签和过渡金属配合物的组合。利用去年的研究成果，我们用导入了标签的化合物标记了细胞内的目标蛋白质，并通过酶消化从提取的蛋白质混合物中制备了肽片段混合物。我们尝试使用固定在固相载体上的金属络合物来捕获并浓缩该肽，结果成功地浓缩并检测了目标肽片段。另一方面，今年我们还研究了去年不同的标签和金属配合物的组合，并成功捕获了带有标签的肽。还证实可以将新标签引入共价酶抑制剂中，与酶形成共价键后，可以捕获并浓缩含有修饰位点的肽片段。

项目成果

タンパク質アシル化の同定を指向したアルキン修飾ペプチド直接濃縮法の開発

开发用于鉴定蛋白质酰化的炔烃修饰肽的直接富集方法

• 发表时间: 2021
• 作者: 小池晃太;どど孝介;則次恒太; 伊藤昭博;袖岡幹子
• 通讯作者: 袖岡幹子

蛋白質アダクトの同定を目指したアルキンタグ解析技術の開発

开发旨在鉴定蛋白质加合物的炔标签分析技术

• 发表时间: 2022
• 作者: 原田真侑子;坂本卓磨;天竺桂弘子;どど孝介
• 通讯作者: どど孝介