Elucidation of the regulatory mechanism of integrin-harboring vesicles for the suppression of pathogenic vesicles

阐明携带整合素的囊泡抑制致病性囊泡的调节机制

基本信息

批准号：
20K07331
负责人：
近藤直幸
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究課題では, リンパ球の活性化やホーミングの過程において細胞間接着を介して重要な働きを担う接着分子である白血球インテグリンLFA-1を含む小胞の生成・輸送過程に注目し,その制御機構の解明を目指して実験を進めている。本年度は、前年度までに確立したスピニングディスク型超解像共焦点顕微鏡Dragonflyを用いたイメージング手法を用いて、様々な因子との共局在を超解像レベルで解析し、LFA-1の輸送に関わる因子をいくつか同定した。前年度までの解析からLFA-1のリガンドであるICAM-1の結合依存的に誘導されるシグナル (outside-in シグナル)依存的にLFA-1細胞内小胞が顕著に形成されることをLFA-1に融合させたSNAPtagを生きた細胞内で共有結合により蛍光標識して可視化することにより明らかにしていた。リンパ球にoutside-inシグナルをICAM-1やLFA-1の活性型構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて導入した後にパラホルムアルデヒドで固定しLFA-1含有小胞に局在する分子を蛍光免疫染色により調べたところ、この小胞にはRab7やRab8が特異的に共局在した。CRISPR-Cas9法を用いてRab7やRab8が欠損したリンパ球を作製し、その細胞接着能を調べたところ、接着能は野生型と比べて有意に低下した。さらに、細胞接着面におけるLFA-1の集積度合をLFA-1の機能に影響を与えない抗LFA-1抗体を用いて評価したところ、Rab7やRab8欠損リンパ球では集積が顕著に低下していることが明らかになった。以上の結果からRab7やRab8はoutside-in刺激依存的にLFA-1の接着面への輸送を制御する新規の因子であることが示唆された。

在本研究项目中，我们重点关注含有白细胞整合素LFA-1的囊泡的产生和运输过程，并对其调控进行了实验，LFA-1是一种在淋巴细胞活化和归巢中发挥重要作用的粘附分子。阐明机制。今年，我们将使用旋转盘超分辨率共焦显微镜 Dragonfly 的成像方法，在超分辨率水平上分析 LFA-1 与各种因素的共定位，我们在去年建立了该显微镜，确定了几个相关因素。到直到前一年进行的分析表明，LFA-1细胞内囊泡以依赖于LFA-1的配体ICAM-1的结合依赖性信号（外向内信号）的方式显着形成，这是通过共价结合揭示的。荧光标记并可视化活细胞中与 -1 融合的 SNAPtag。使用特异性识别 ICAM-1 或 LFA-1 活性结构的单克隆抗体将由外向内的信号引入淋巴细胞后，用多聚甲醛固定位于含有 LFA-1 的囊泡中的分子，然后通过免疫荧光染色检查 Rab7。和 Rab8 特异性地共定位于这些囊泡中。当使用CRISPR-Cas9方法创建缺乏Rab7或Rab8的淋巴细胞并检查其细胞粘附能力时，粘附能力明显低于野生型。此外，当我们使用不影响LFA-1功能的抗LFA-1抗体评估细胞粘附表面上LFA-1积累的程度时，我们发现在Rab7和Rab8缺陷的淋巴细胞中积累显着减少。事情变得很清楚了。这些结果表明 Rab7 和 Rab8 是以由外向内刺激依赖性方式控制 LFA-1 向粘附表面转运的新因子。