Elucidation of the conserved mechanism of division plane determination in land plants

陆地植物划分面确定保守机制的阐明

基本信息

批准号：
20K06693
负责人：
幸節健
金额：
$ 2.75万
依托单位：
National Institute for Basic Biology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

動物、植物ともに、細胞がどの方向に分裂するかは、正常な発生に大きな影響を与える。申請者は基部陸上植物ヒメツリガネゴケにおいて細胞分裂面は中心体様構造を起点とした紡錘体軸の決定、細胞質分裂装置であるフラグモプラストの親細胞壁への適切なガイダンスによりなされることを見出した。本研究では、紡錘体軸の決定機構、細胞質分裂装置の親細胞壁へのガイダンス機構を調べることで、分裂面制御機構を解明することを目的とする。(1)ヒメツリガネゴケを用いて中心体様構造物の形成機構を解析。(2)真核生物に広く保存される細胞分裂に必須なAuroraキナーゼの解析。これらの解析で、紡錘体軸の決定、フラグモプラストの親細胞壁へのガイダンスメカニズムを明らかにすることを試みた。(1)の研究成果。RNA-seq法で同定済みの初期茎葉体で発現変動する遺伝子の中に、微小管の束化活性を有するMAP65dとMAP65eがあった。前年度にこれら遺伝子の解析を行い、二重変異体において野生型と比較して形態に異常は観察されず、細胞分裂面制御をしていないことが示唆された。そこで、もう一つ機能が重複する遺伝子としてMAP65fを想定し、この遺伝子の機能欠損変異株作製を試みた。(2)の研究成果。前年度にAuroraキナーゼの基質を同定するために、Auroraキナーゼにビオチンリガーゼ(BirA)を融合した遺伝子を持つ形質転換株を作製した。この形質転換体からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットによってビオチン化されたタンパク質を検出した。その結果、野生型のビオチン化されているタンパク質以外の分子量のタンパク質は検出されなかった。用いたビオチンリガーゼが大腸菌由来であるために、植物の生育温度が活性に必要な至適温度ではないと考えた。そこでビオチンリガーゼ活性の至適温度が改変されたTurboIDを取り寄せ、形質転換体を作製した。

在动物和植物中，细胞分裂的方向对正常发育有重大影响。申请人发现，在基础陆生植物肌骨立碗藻中，细胞分裂的平面是通过确定从类中心体结构开始的纺锤轴并通过向成膜体的亲本细胞壁（即胞质分裂装置）提供适当的引导来确定的。。在本研究中，我们旨在通过研究纺锤体轴的决定机制以及胞质分裂器对亲代细胞壁的引导机制来阐明控制分裂面的机制。 (1)利用苔藓立碗藓(Physcomitrella)分析类中心体结构的形成机制。 (2) 极光激酶的分析，极光激酶是细胞分裂所必需的，在真核生物中广泛保守。通过这些分析，我们试图确定纺锤体轴并阐明成膜体对母细胞壁的引导机制。 (一)研究成果。通过RNA-seq方法鉴定的早期芽中表达波动的基因中，发现了具有微管成束活性的MAP65d和MAP65e。我们在前一年分析了这些基因，发现与野生型相比，双突变体在形态上没有异常，这表明它们不控制细胞分裂平面。因此，我们将MAP65f设想为另一个具有重叠功能的基因，并试图创建该基因的功能缺陷突变株。（二）研究成果。去年，为了鉴定极光激酶的底物，我们创建了极光激酶和生物素连接酶（BirA）基因融合的转化菌株。从该转化体中提取蛋白质，并通过蛋白质印迹法检测生物素化蛋白质。结果，没有检测到除野生型生物素化蛋白质以外的分子量的蛋白质。由于所使用的生物素连接酶来源于大肠杆菌，因此认为植物生长温度并不是活性所需的最佳温度。因此，我们订购了TurboID，其中修改了生物素连接酶活性的最适温度并创建了转化体。