シングルセル解析による内リンパ嚢の発生メカニズムの解明

通过单细胞分析阐明内淋巴囊发育机制

基本信息

批准号：
21K09602
负责人：
本田圭司
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前庭水管拡大症は先天性難聴で最も頻度の高い内耳奇形である。前庭水管拡大症の多くは常染色体劣性遺伝の形式をとり、難聴と甲状腺腫を特徴とするペンドレッド症候群、または甲状腺腫を伴わない非症候性難聴DFNB4に伴って発症する。その原因遺伝子は、細胞膜で陰イオントランスポーターとして機能するペンドリン/SLC26A4 である。ペンドリンは内耳では蝸牛の外ラセン溝細胞、前庭の移行細胞、および内リンパ嚢のイオノサイトである mitochondria-rich cell (MRC)に発現する。近年の研究から、胎生期の内リンパ嚢において内リンパ吸収を担っている MRC の機能不全が、この疾患の病態に強く関与することがわかってきた。本研究の目的は、シングルセル遺伝子解析を用いて、マウス内リンパ嚢の MRCがどのような機構で分化するのかを明らかにすることにある。本研究で得られた成果から、生体内での前駆細胞から MRC への分化誘導や、ES/iPS 細胞から分化した細胞の移植といった戦略により、前庭水管拡大症の治療法の確立につながることが期待できる。初年度は内リンパ嚢の単一細胞懸濁液を効率的に収集する処理方法を検討した。当初計画していたcollagenase+Dispaseの混合液ではなく、LiberaseTM+Dnaseで 37℃、30分振盪するプロトコルがもっとも生細胞を効率よく収集できることが判明した。このプロトコルにて、野生型(C57BL/6J)妊娠マウス1匹より胎生14.5日齢の胎仔を10匹採取し、顕微鏡下で内リンパ嚢を周辺組織を含めて摘出した。採取組織をプールして単一細胞に解離し、Chromium ControllerシステムでシングルセルcDNAライブラリを作成しRNA-seqを行った。得られたシングルセルデータに対し、Rの各種シングルセル解析パーケージを用いて、クラスタリングと発現変動遺伝子の検出、各クラスターのアノテーション、エンリッチメント解析、軌道解析を行った。

前庭导水管扩大是与先天性听力损失相关的最常见的内耳畸形。大多数前庭导水管扩张病例以常染色体隐性方式遗传，与 Pendred 综合征（其特征为听力损失和甲状腺肿）或 DFNB4（非综合征性听力损失，无甲状腺肿）相关。致病基因是pendrin/SLC26A4，它在细胞膜中充当阴离子转运蛋白。在内耳中，pendrin 表达于耳蜗的外螺旋沟细胞、前庭的移行细胞和富含线粒体的细胞 (MRC)（内淋巴囊中的离子细胞）中。最近的研究表明，胚胎期负责内淋巴囊内淋巴吸收的 MRC 功能障碍与该疾病的病理密切相关。本研究的目的是利用单细胞基因分析来阐明小鼠内淋巴囊中MRC的分化机制。本研究获得的结果可能会导致通过体内诱导祖细胞分化为MRC以及移植由ES/iPS细胞分化的细胞等策略来建立前庭导水管扩张的治疗方法。第一年，我们研究了一种从内淋巴囊有效收集单细胞悬浮液的处理方法。事实证明，使用 LiberaseTM + Dnase 在 37℃ 下振荡 30 分钟的方案是收集活细胞最有效的方法，而不是按原计划使用胶原酶 + Dispase 混合物。根据该方案，从一只怀孕的野生型（C57BL/6J）小鼠中收集10个14.5天大的胎儿，并在显微镜下切除内淋巴囊（包括周围组织）。将收集的组织汇集并解离成单细胞，并使用 Chromium Controller 系统创建单细胞 cDNA 文库并进行 RNA-seq。使用各种R单细胞分析包对获得的单细胞数据进行聚类、差异表达基因的检测、每个簇的注释、富集分析和轨迹分析。